電刺激對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)生長因子表達的影響

李秀紅

【關(guān)鍵詞】大鼠;電刺激;脊髓損傷;神經(jīng)生長因子;神經(jīng)修復(fù)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，脊髓部位極易受損。而脊髓損傷可嚴重影響人的脊柱健康，致殘率高，甚至危及患者生命。目前，脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)仍屬于世界性難題，神經(jīng)生長因子作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的典型代表，其可在一定條件下促進未損傷神經(jīng)元出芽，從而有利于被破壞神經(jīng)回路的重建。因此，神經(jīng)生長因子對脊髓損傷后的重建發(fā)揮著重要作用。電刺激是通過發(fā)出接近人體生物電的微量電流來促進神經(jīng)生長因子的表達，從而促進受損神經(jīng)元恢復(fù)、修復(fù)脊髓損傷。本實驗旨在觀察電刺激對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)生長因子表達的影響，從而為臨床治療提供借鑒。

1材料與方法

1.1實驗動物選取健康成年SD大鼠48只，體重（196±20.3）g，雌雄不限。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度在20～25℃。隨機分成3組，正常組（n=16）、電刺激組（n=16）和損傷對照組（n=16），各組再分成造模后1d、3d、5d、7d亞組，每個亞組4只。

1.2方法

1.2.1制備動物模型：電刺激組及損傷對照組大鼠均腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉45mg/kg進行麻醉，并給予背部剃毛、消毒，并切開皮膚及皮下組織，使得棘突與椎板暴露，將T9椎板咬除，然后采用沖擊棒在高度為25mm處使大鼠自由墜落致使脊髓損傷，縫合傷口。精心護理并獨籠飼養(yǎng)，并給予協(xié)助排尿、抗菌、補充體液，預(yù)防壓瘡、感染等，一直持續(xù)到大鼠取材，正常組切除相應(yīng)椎板并給予切口縫合。

1.2.2電刺激：電刺激組大鼠于術(shù)后24h開始給予經(jīng)皮電刺激，每次30min，1次/d，直至取材。采用疏密波脈沖電流，選擇中檔電流強度，以10Hz為刺激頻率，負極與右下肢小腿位置的皮膚連接，正極與損傷部位上緣約2cm處皮膚連接。

1.2.3取材：術(shù)后1d、3d、5d、7d時對各組大鼠進行取材，采用高劑量戊巴比妥鈉過度麻醉大鼠，然后左心室插管、右心耳剪開，灌注冰生理鹽水、肝素鈉，見右心耳流出澄清液后再灌注4%多聚甲醛1h，將椎弓管打開，切除T7-T11段脊髓，并進行固定，24h后進行脫水、修片、切片、貼片、烤片，處理完成后備用。

1.2.4免疫組織化學染色：采取非生物素二步法對神經(jīng)生長因子免疫組化染色，先將各組切片脫蠟、梯度酒精水化，然后高壓熱抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶及特異性抗原，再將NGF抗體滴入后冰箱過夜。采用兔抗鼠二抗在溫度為37℃恒溫狀態(tài)下孵育1h，加DAB-H2O2顯色液到切片，室溫環(huán)境下反應(yīng)并采用顯微鏡觀察，然后漂洗、復(fù)染、脫水，樹膠封片。通過顯微鏡觀察神經(jīng)生長因子表達，見棕黃色反應(yīng)為陽性。

1.3觀察指標觀察脊髓內(nèi)神經(jīng)生長因子陽性產(chǎn)物的分布情況，并對各組脊髓內(nèi)、中、外的神經(jīng)生長因子陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計，測量其平均積分光密度值。

1.4數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.O，用（π±s）表示計量資料，采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

見表1，電刺激1d時，電刺激組的神經(jīng)生長因子平均積分光密度值及陽性神經(jīng)元數(shù)相對于正常組和損傷對照組有所增加，但無顯著性差異（P>0.05）;電刺激3d、5d、7d時電刺激組和損傷對照組的上述兩項指標顯著高于正常組（P<0.05），電刺激5d、7d時，電刺激組的上述兩項指標顯著高于損傷對照組和正常組（P<0.05）。

3討論

研究證實，神經(jīng)元軸突生長及定向致靶狀況以及神經(jīng)元的存活質(zhì)量是脊髓損傷后功能恢復(fù)的重要影響因素。神經(jīng)生長因子屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族中的重要一員，其來源于靶組織，并對神經(jīng)元產(chǎn)生逆向營養(yǎng)作用，對促進靶器官與皮質(zhì)脊髓束建立聯(lián)系有重要作用，而且可逆轉(zhuǎn)受損神經(jīng)元的萎縮，從而提高神經(jīng)元存活率，促進受損神經(jīng)的修復(fù)。

本實驗結(jié)果顯示，電刺激開始后，隨著電刺激時間的延長，電刺激組的神經(jīng)生長因子表達成上升趨勢，電刺激3d、5d、7d時電刺激組和損傷對照組的神經(jīng)生長因子平均積分光密度值及陽性神經(jīng)元數(shù)顯著高于正常組，電刺激5d、7d時，電刺激組的上述兩項指標顯著高于損傷對照組和正常組（P<0.05），本實驗結(jié)果提示兩點：一是脊髓損傷后，神經(jīng)生長因子分泌增加，相比未發(fā)生脊髓損傷組呈現(xiàn)高表達;二是電刺激治療有助于刺激神經(jīng)生長因子分泌，進一步增加其在脊髓損傷部位的含量。研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后，其神經(jīng)生長因子加速分泌，從而發(fā)揮其維持受損部位神經(jīng)元存活、促進神經(jīng)纖維再生等作用，可見，神經(jīng)生長因子在促進受損神經(jīng)元修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。研究證實，對于中重度脊髓損傷來說，在沒有外界干預(yù)情況下，受損機體的內(nèi)源性神經(jīng)生長因子表達量并不能完全達到保護和修復(fù)神經(jīng)元的水平，而且其維持時間較短。因此，不少學者提出通過增加外源性神經(jīng)生長因子的表達來滿足受損機體神經(jīng)元修復(fù)所需，從而促進受損神經(jīng)元的快速康復(fù)，本實驗結(jié)果證實了這一建議的可行性。實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮電刺激治療將微量電流的正負極分別與T 9右側(cè)夾脊穴和右下肢足三里穴相連接，從而在受損區(qū)周圍搭建了一個外在電場，通過電流刺激來提高神經(jīng)生長因子的分泌。本實驗中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子免疫反應(yīng)陽性物多集中于大鼠灰質(zhì)前角神經(jīng)元內(nèi)，并多數(shù)定位于細胞核和胞漿中，說明電刺激后刺激受損區(qū)域有助于增加其神經(jīng)生長因子的分泌，與以往文獻結(jié)果一致。

綜上所述，脊髓損傷后電刺激能夠誘導大鼠損傷區(qū)神經(jīng)生長因子的表達，這將為損傷區(qū)神經(jīng)元的恢復(fù)創(chuàng)造有利的微環(huán)境。