重大病毒疫情與診斷試劑

劉東來，張春濤

重大病毒疫情是新興或已知病毒在人群中以極高感染率和極快傳播速度引起的大規(guī)模流行，具有影響范圍廣、傳播速度快、社會危害性大等特點(diǎn)，對人類健康和社會安定構(gòu)成重大威脅[1]?？焖偾覝?zhǔn)確地診斷出導(dǎo)致疫情暴發(fā)的病原體從而有效隔離感染者，是疫情防控的重要基礎(chǔ)。另外，通過對疫情相關(guān)的病毒進(jìn)行主動(dòng)監(jiān)測，能夠在疫情初期判斷暴發(fā)態(tài)勢及傳播軌跡，從而更有效地控制疫情發(fā)展。近年來在應(yīng)對重大病毒病疫情時(shí)，WHO和各國政府均在較短時(shí)間內(nèi)緊急批準(zhǔn)了相關(guān)診斷試劑[2-3]，這些診斷試劑在疫情應(yīng)急防控工作中發(fā)揮了不可替代的作用。例如2015年，埃博拉病毒診斷試劑幫助利比里亞衛(wèi)生部門將感染者的發(fā)現(xiàn)和隔離時(shí)間從6.0 d降至1.5 d，從而很快地控制了疫情傳播[4]。

建立快速響應(yīng)且行之有效的病毒診斷能力往往受到很多客觀因素的限制。缺少對疫情病原的了解，所用診斷技術(shù)的復(fù)雜性，現(xiàn)場條件嚴(yán)苛艱苦及檢測時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本受限等，導(dǎo)致檢測人員不足，檢測儀器和機(jī)構(gòu)分配不足，檢測結(jié)果報(bào)告延遲等，嚴(yán)重影響和阻礙了疫情的應(yīng)急處置工作[5]。隨著近年來現(xiàn)場檢驗(yàn)（point-of-care testing,POCT）技術(shù)的快速發(fā)展，病毒診斷試劑的響應(yīng)速度和適應(yīng)性都得到極大提高。在未來的疫情防控工作中，診斷試劑將扮演越來越重要的角色。本文對近年來發(fā)生的重大病毒疫情進(jìn)行回溯，并對疫情相關(guān)診斷技術(shù)、疫情相關(guān)診斷試劑的準(zhǔn)備等方面進(jìn)行綜述，以利于更深入理解疫情的危害性以及診斷試劑的重要意義。

1 近年來重大病毒疫情回溯

2002 2003年，重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARSCoV）在中國引發(fā)非典疫情，導(dǎo)致8098人感染，其中774人死亡，影響37個(gè)國家和地區(qū)，造成嚴(yán)重的社會恐慌和重大經(jīng)濟(jì)損失[6]。該病毒起源于中國云南省某洞穴里的蝙蝠，是一個(gè)全新的冠狀病毒[7]。我國國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration,NMPA）于2009年批準(zhǔn)過2個(gè)抗體類和1個(gè)抗原類診斷試劑；美國FDA于2005年批準(zhǔn)過1個(gè)核酸類和1個(gè)抗體類研究器械豁免診斷試劑。

2009 2010年，本世紀(jì)首次全球性流感大流行由墨西哥始發(fā)并蔓延至全球，約造成28萬例死亡病例，其中多數(shù)發(fā)生在非洲和東南亞地區(qū)[8]。引發(fā)此次疫情的病原是一個(gè)多重重組的甲型H1N1流感病毒，其主要基因來源于豬流感病毒，因此又被非正式地稱為豬流感[9]。我國NMPA于2009 2014年批準(zhǔn)過8個(gè)核酸類和1個(gè)抗原類診斷試劑；美國FDA于2009 2010年批準(zhǔn)過18個(gè)核酸類 緊急使用授權(quán) （emergency use authorization,EUA）診斷試劑。

2012年，一種新的冠狀病毒 中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）在中東地區(qū)開始流行。2015年MERS-CoV首次在中東以外的地區(qū)韓國暴發(fā)流行，同時(shí)我國也出現(xiàn)1例輸入性感染病例。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，截至2018年6月共有來自中東、北非、亞洲等27個(gè)國家和地區(qū)報(bào)告的2229例確診感染病例，其中791例死亡[10]。該病毒盡管最初被認(rèn)為與SARS-CoV高度相似，但隨后研究表明其人間傳播能力較弱。我國NMPA于2017年批準(zhǔn)過1個(gè)核酸類診斷試劑；美國FDA于2013 2015年批準(zhǔn)過18個(gè)核酸類EUA診斷試劑。

2013年，甲型H7N9禽流感病毒疫情在中國暴發(fā)，約137人感染，其中45人死亡[11]。此次疫情的特殊性在于該病毒無禽類致病性，卻對人具有高致病性，而此前從未有過該病毒能夠感染人類的報(bào)道。我國NMPA于2013 2016年批準(zhǔn)過4個(gè)核酸類和1個(gè)抗原類診斷試劑；美國FDA于2013 2014年批準(zhǔn)過2個(gè)核酸類和1個(gè)抗原類EUA診斷試劑。

2013 2016年，西非暴發(fā)了史上最大規(guī)模的埃博拉病毒病疫情，導(dǎo)致28 616例感染病例和11 310例死亡病例，嚴(yán)重影響了疫區(qū)內(nèi)外的三大洲十余個(gè)國家，并在全球引發(fā)疫情警報(bào)[12]。這個(gè)1976年才發(fā)現(xiàn)的病毒，能夠通過體液接觸的方式感染包括人在內(nèi)的靈長類動(dòng)物并引發(fā)出血熱。2014 2015年，我國NMPA批準(zhǔn)過5個(gè)核酸類診斷試劑；WHO批準(zhǔn)過5個(gè)核酸類和2個(gè)抗原類 緊急使用評估和名單 （emergency use assessment and listing,EUAL）診斷試劑；美國FDA批準(zhǔn)過8個(gè)核酸類和1個(gè)抗原類EUA診斷試劑。

2015 2016年，由埃及伊蚊傳播的寨卡病毒在巴西暴發(fā)感染并引發(fā)全球性疫情，波及70余個(gè)國家和地區(qū)。這個(gè)于1947年首次分離出來的病毒，盡管對感染者本身的健康影響輕微，但卻能通過母嬰傳播從而對胎兒的大腦造成極大的損害，導(dǎo)致新生兒小頭癥[13]。2016 2017年，我國NMPA批準(zhǔn)過3個(gè)核酸類診斷試劑；WHO批準(zhǔn)過2個(gè)核酸類EUAL診斷試劑；美國FDA批準(zhǔn)過12個(gè)核酸類和3個(gè)抗體類EUA診斷試劑。

2017年，古老的鼠疫在馬達(dá)加斯加死灰復(fù)燃，造成超過2400例感染病例和200例死亡病例。同年，甲型H7N9禽流感疫情在中國重發(fā)，其嚴(yán)重程度超過2013年。2018年，埃博拉病毒病疫情在非洲剛果卷土重來。這些新發(fā)、重發(fā)的病毒疫情時(shí)刻提醒我們要做好準(zhǔn)備工作以應(yīng)對隨時(shí)可能到來的下一次疫情。

2 疫情相關(guān)診斷技術(shù)

在疫情初期實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確的病毒診斷，對于控制疫情發(fā)展極為關(guān)鍵。而建立及時(shí)高效的病毒診斷能力，離不開高質(zhì)量且能夠在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模供應(yīng)的診斷試劑。目前大多數(shù)商品化診斷試劑都是為醫(yī)療條件發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)設(shè)計(jì)的，須要滿足基本的實(shí)驗(yàn)條件，如可靠的電力供應(yīng)，清潔的水供應(yīng)，溫度可控的儲存條件，有效的維護(hù)保障以及具有專業(yè)知識的實(shí)驗(yàn)人員等，因此不適合在病毒疫情多發(fā)、醫(yī)療條件有限的中低收入國家大規(guī)模應(yīng)用。2004年，WHO提出了病毒疫情診斷試劑研發(fā)的7項(xiàng)原則，即可負(fù)擔(dān)、靈敏（假陰性少）、特異（假陽性少）、易操作、檢測速度快且適應(yīng)性強(qiáng)（可常溫儲存）、無設(shè)備要求和可及性強(qiáng)[14]。近年來，具有上述優(yōu)點(diǎn)的抗原或抗體類和核酸類POCT診斷試劑已廣泛應(yīng)用于疫情相關(guān)病毒的診斷和監(jiān)控工作中。

2.1 抗原或抗體類POCT診斷試劑 抗原或抗體類診斷試劑的技術(shù)原理通常是采用敏感且特異、偶聯(lián)某個(gè)比色標(biāo)記的結(jié)合抗體或適配體，通過色譜分析或酶促反應(yīng)檢測樣本中的病毒抗原。側(cè)向流動(dòng)技術(shù)（lateral flow assay,LFA）也稱側(cè)向流動(dòng)免疫色譜技術(shù)，使用固定在紙上的抗體或適配體捕獲樣品中的待測物，再通過比色標(biāo)記進(jìn)行檢測[15]。應(yīng)用多種比色報(bào)告分子、納米銀離子、不同顏色的乳膠微珠等新技術(shù)，LFA試劑可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對多個(gè)待測物，如登革病毒、黃熱病毒和埃博拉病毒進(jìn)行檢測[16]。微流體紙質(zhì)裝置（micro fluidic paper-based device,μPAD）是將疏水性蠟屏障整合到紙上，從而通過控制液體流動(dòng)來控制酶促小分子比色反應(yīng)[17]。通過在檢測區(qū)添加不同的緩沖液和試劑，能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對多種待測物、陰性和陽性對照進(jìn)行檢測。另外，還可以在μPAD中整合血漿分離膜，從而簡化全血樣本的處理流程。以上POCT診斷試劑無需特殊設(shè)備，對于樣本收集無特殊要求，操作簡便且檢測時(shí)間短，約10～25 min，因此更適合在醫(yī)療條件有限的情況下進(jìn)行快速疫情病毒診斷。

2.2 核酸類POCT診斷試劑 核酸診斷試劑通過檢測病原體的基因組DNA或RNA來檢測病毒，還能通過對病毒核酸定量來監(jiān)測感染狀態(tài)，相比抗原或抗體類診斷試劑具有更高的特異性和敏感性。通常，核酸檢測流程繁瑣，包括樣品制備、靶向擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測等步驟，且需要穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和中大型儀器設(shè)備。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，很多滿足集成化、自動(dòng)化和小型化等POCT標(biāo)準(zhǔn)的診斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。這些核酸類POCT診斷試劑的技術(shù)原理既包括傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）、PCR-熔解曲線、基因芯片雜交[18]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[19]以及重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplifcation,RPA）[20]等；也包括基因編輯CRISPR[21]、第二代測序技術(shù)以及英國牛津納米技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies,ONT）的MinION測序儀[22]代表的第三代測序技術(shù)。

應(yīng)用RTFQ-PCR和PCR-熔解曲線等傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)的小型化分子診斷平臺，如賽沛（上海）商貿(mào)有限公司的GeneXpert和梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的FilmArray，可以在手提箱大小的儀器上實(shí)現(xiàn)簡單、快速、全自動(dòng)的 從樣本到結(jié)果一站式病毒核酸檢測[23-24]。這些核酸類POCT診斷試劑，由非專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作即可在較為嚴(yán)苛的環(huán)境中進(jìn)行疫情病毒的現(xiàn)場檢測，在以往的埃博拉病毒病、寨卡病毒病等疫情的防控工作中均發(fā)揮過重要作用。另外，分子診斷的平臺化發(fā)展，有利于生產(chǎn)企業(yè)在疫情初期根據(jù)病毒基因組序列特征對檢測體系進(jìn)行微調(diào)，從而保證產(chǎn)品的有效性和時(shí)效性。

近年來基于基因編輯和第二、三代測序等前沿技術(shù)的病毒診斷試劑也相繼在疫情防控實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用。2017年，Gootenberg等[21]應(yīng)用CRISPR和RPA技術(shù)在無須進(jìn)行核酸提取情況下可直接從人體樣本中檢測登革病毒、寨卡病毒等病原體，檢測時(shí)間在2 h內(nèi)且靈敏度高，可低至1拷貝/ml。2018年，來自美國、尼日利亞、英國等多國的研究人員應(yīng)用ONT的MinION測序儀對尼日利亞拉沙病毒病疫情的病原體基因組序列進(jìn)行了現(xiàn)場分析，迅速判斷出感染者數(shù)量的突增并非由病毒變異導(dǎo)致，同時(shí)也確認(rèn)該病毒不能在人間傳播。這些發(fā)現(xiàn)有效地指導(dǎo)了當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門重點(diǎn)關(guān)注對病毒宿主大鼠的控制，而非設(shè)置疫情隔離區(qū)[25]。

3 疫情相關(guān)診斷試劑的準(zhǔn)備

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，對于11種優(yōu)先考慮的疫情高風(fēng)險(xiǎn)病毒，包括克里米亞-剛果出血熱病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉薩熱病毒、MERS-CoV、SARS-CoV、尼帕病毒、亨尼帕病毒、裂谷熱病毒、寨卡病毒以及X病毒，WHO僅批準(zhǔn)過埃博拉病毒、MERS-CoV和寨卡病毒診斷試劑，其余8種尚缺少相關(guān)診斷試劑[26]。這是由于病毒疫情經(jīng)常發(fā)生在中低收入國家，且具有零散和不可預(yù)測性，因此疫情相關(guān)診斷試劑的研發(fā)模式不適合以市場為導(dǎo)向。各國政府和WHO均在探索合理的研發(fā)和激勵(lì)模式，通過鼓勵(lì)企業(yè)加大研發(fā)投入，改進(jìn)監(jiān)管策略等措施，保障并不斷增強(qiáng)與疫情相關(guān)診斷試劑的研發(fā)和生產(chǎn)能力。

3.1 WHO關(guān)于疫情相關(guān)診斷試劑的政策 WHO在全球開展了 研發(fā)藍(lán)圖 計(jì)劃，鼓勵(lì)研發(fā)針對具有潛在疫情風(fēng)險(xiǎn)的病毒診斷試劑。該計(jì)劃將推動(dòng)人們更好地了解病毒與人類的關(guān)系，填補(bǔ)既往疫情的知識空白，積累更多臨床安全性數(shù)據(jù)，以及監(jiān)控并預(yù)測能夠?qū)е滦乱咔榈臐撛诓《镜?。WHO希望 研發(fā)藍(lán)圖 計(jì)劃的參與者能夠基于相同的集成化平臺研發(fā)針對幾種優(yōu)先考慮的病毒候選診斷試劑，在疫情大規(guī)模流行前完成臨床安全性評價(jià)，并在疫情初期盡快完成臨床有效性評價(jià)，從而能夠加快病毒疫情診斷試劑由研發(fā)到規(guī)?；a(chǎn)的轉(zhuǎn)化速度，以利于能在疫情早期及時(shí)提供診斷試劑。

2015年，WHO發(fā)布《在公共衛(wèi)生緊急情況下候選診斷試劑的緊急使用評估和清單程序指南》，通過EUAL審批的診斷試劑可以供聯(lián)合國采購機(jī)構(gòu)和WHO會員國的監(jiān)管機(jī)構(gòu)參考采購和使用[3]。EUAL是WHO在公眾健康安全面臨嚴(yán)重威脅的情況下啟動(dòng)的特殊審評程序，旨在基于最低限度的質(zhì)量、安全和性能數(shù)據(jù)，最大程度地提高診斷試劑的時(shí)效性。按照EUAL程序，WHO可以放寬對診斷試劑分析性能數(shù)據(jù)的要求，如企業(yè)在申請時(shí)可暫不提交完整的驗(yàn)證和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，而可以在審評過程中另行補(bǔ)充。盡管如此，WHO仍然要求進(jìn)入EUAL程序的新的診斷試劑提交完整的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用以充分證明其臨床有效性。

3.2 美國FDA關(guān)于疫情相關(guān)診斷試劑的政策 美國FDA在保護(hù)美國免受重發(fā)、新發(fā)病毒疫情的威脅方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2010年，美國FDA通過與美國疾病控制與預(yù)防中心、美國國防部等機(jī)構(gòu)緊密合作，提出了 醫(yī)療對策倡議 計(jì)劃，旨在建立有效的監(jiān)管政策和機(jī)制為疫情相關(guān)疫苗、藥品和診斷試劑提供靈活明確的監(jiān)管途徑，及時(shí)促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和審批。2013年，美國頒布《2013年流行病和全面災(zāi)害準(zhǔn)備再授權(quán)法案》，以加強(qiáng)國家應(yīng)對重大疫情的準(zhǔn)備。該法案還授權(quán)美國FDA可以組建專門下屬機(jī)構(gòu)，并開展相關(guān)活動(dòng)，從而建立更高效的疫情應(yīng)急響應(yīng)機(jī)制，根據(jù)疫情防控工作的具體需要提供專業(yè)的科學(xué)和監(jiān)管知識，同時(shí)促進(jìn)疫情相關(guān)產(chǎn)品的審批[27-28]。

2017年，美國健康與人類服務(wù)部和FDA聯(lián)合發(fā)布的《醫(yī)療產(chǎn)品及相關(guān)機(jī)構(gòu)的緊急使用授權(quán)指導(dǎo)原則》中規(guī)定，根據(jù)美國《食品、藥品和化妝品法案》第564條，當(dāng)公眾和軍隊(duì)在遭受重大病毒疫情威脅時(shí)，美國FDA可以對相關(guān)的診斷試劑進(jìn)行EUA審批，從而保證其能夠在最短時(shí)間內(nèi)用于疫情的防控工作[27-28]。盡管為了保證緊急授權(quán)的時(shí)效性，EUA的審評標(biāo)準(zhǔn)略有放松，例如EUA對產(chǎn)品有效性的要求放寬為對疫情的診斷和防控

可能有效 ，但是EUA仍然是一套包含了啟動(dòng)、評估、授權(quán)和終止授權(quán)等全要素的完整且科學(xué)的審評機(jī)制。

3.3 我國關(guān)于疫情相關(guān)診斷試劑的政策 為了預(yù)防、控制和消除傳染病的發(fā)生與流行，保障人民身體健康和公共衛(wèi)生安全，我國于2004年發(fā)布了修訂后的《中華人民共和國傳染病防治法》。國家、省級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)對傳染病發(fā)生、流行以及分布進(jìn)行監(jiān)測，對重大傳染病流行趨勢進(jìn)行預(yù)測，提出預(yù)防控制對策，參與并指導(dǎo)對暴發(fā)疫情的調(diào)查和處理[29]。

當(dāng)重大病毒疫情發(fā)生時(shí)，國家衛(wèi)生健康委員會第一時(shí)間發(fā)布的防控方案對于疫情應(yīng)急處置工作具有重要指導(dǎo)意義，這些方案包括《人感染H7N9禽流感診療方案》《埃博拉出血熱防控方案》以及《寨卡病毒病防控方案》等；國家科學(xué)技術(shù)部會根據(jù)實(shí)際情況組織開展應(yīng)急專項(xiàng)研究，加速疫情相關(guān)醫(yī)療產(chǎn)品的研究、轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。此外，國家科學(xué)技術(shù)部在十一五十二五和十三五期間支持過多項(xiàng)傳染病診斷試劑研究專項(xiàng)，希望通過核心技術(shù)突破和關(guān)鍵技術(shù)集成使我國病毒疫情診斷試劑的自主創(chuàng)新能力達(dá)到國際先進(jìn)水平。

為了確保疫情應(yīng)急處置所需診斷試劑能盡快完成注冊審批，我國NMPA先后于2009年和2013年發(fā)布了《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械應(yīng)急審批程序的通知》和《食品藥品監(jiān)管總局辦公廳關(guān)于做好突發(fā)事件應(yīng)急預(yù)案管理辦法貫徹落實(shí)工作的通知》[30-31]。根據(jù)以上政策以及《體外診斷試劑注冊管理辦法》，疫情相關(guān)診斷試劑按照三類體外診斷試劑進(jìn)行審批[32]，且各監(jiān)管環(huán)節(jié)的時(shí)限都得到了最大程度的優(yōu)化和壓縮，有利于保障相關(guān)產(chǎn)品的時(shí)效性[33]。不同于WHO的EUAL指南或美國FDA的EUA指南，我國的監(jiān)管政策沒有規(guī)定可以為了優(yōu)先保證產(chǎn)品的時(shí)效性而對產(chǎn)品的分析性能和臨床試驗(yàn)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行妥協(xié)。

我國相關(guān)部門之間高效的協(xié)作機(jī)制，也保證了國家在應(yīng)對2003年SARS-CoV疫情、2009年甲型H1N1流感疫情、2013年甲型H7N9禽流感疫情、2014年埃博拉病毒病疫情以及2016年寨卡病毒病疫情等近年來的幾次重大病毒疫情時(shí)，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)建立起有效的病毒診斷能力，為我國應(yīng)對突發(fā)病毒性疫情的防控與疾病的診療提供了必要的技術(shù)手段。

4 結(jié) 語

進(jìn)入21世紀(jì)，社會經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)技術(shù)持續(xù)發(fā)展，但重大病毒疫情這柄達(dá)摩克利斯之劍仍高懸于人類健康之上。在2019年1月，WHO發(fā)布的《2019年全球衛(wèi)生面臨的10項(xiàng)威脅》中，就有5項(xiàng)威脅與病毒疫情高度相關(guān)[34]。隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是核酸類POCT診斷技術(shù)的大規(guī)模轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，診斷試劑已經(jīng)成為了重大病毒疫情應(yīng)急處置過程中不可或缺的重要工具。因此，各國政府和WHO都在積極行動(dòng)加強(qiáng)病毒診斷能力。

我國與世界各國和地區(qū)的聯(lián)系日趨緊密，同時(shí)具有人口眾多、密集聚居和城鄉(xiāng)醫(yī)療水平發(fā)展不均衡等特點(diǎn)，面臨病毒疫情的風(fēng)險(xiǎn)與日俱增。只有國家統(tǒng)籌設(shè)計(jì)，各相關(guān)部門積極協(xié)作，建立高效的疫情預(yù)防控制工作網(wǎng)和重點(diǎn)關(guān)注病毒監(jiān)控網(wǎng)，保證高質(zhì)量、高水平的診斷試劑研發(fā)投入，修訂科學(xué)的診斷試劑監(jiān)管政策，才能使我國擁有

招之能來、來之能戰(zhàn)、戰(zhàn)之能勝 的診斷試劑綜合研發(fā)生產(chǎn)能力，從而確保下一次重大病毒疫情來臨之際能夠做好充分的準(zhǔn)備和應(yīng)對工作。