燕窩低聚肽制備工藝及生物學(xué)評(píng)價(jià)

高建萍,姚之龍,張貴鋒

(1.中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.衡水第一中學(xué)，衡水 053000)

燕窩含多種蛋白和碳水化合物，蛋白質(zhì)主要以糖蛋白的形式存在[1-2]。近年來大量研究表明食用燕窩具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血壓和提高代謝速率等多種價(jià)值[3-4]。燕窩中的糖蛋白主要以黏蛋白的形式存在，唾液酸是其主要的糖基[5]。天然黏蛋白通過酶法進(jìn)行降解存在一定難度，隨著年齡的增長，人體分泌的蛋白酶逐漸下降，人體攝入蛋白之后存在難以消化及蛋白質(zhì)生物利用度不高等問題，因此，采用體外降解將燕窩制備成低聚肽的技術(shù)引起廣泛關(guān)注[6]。

燕窩中非水溶性成分經(jīng)模擬胃腸液降解后會(huì)釋放出黏液素、幾丁質(zhì)酶類似物和部分球蛋白的降解物[7]。劉琳等采用糖苷酶將非變性的燕窩黏蛋白進(jìn)行預(yù)處理，采用蛋白酶進(jìn)行降解，酶解產(chǎn)物中檢測出與生長因子具有相同局部序列的蛋白[8]。燕窩經(jīng)過80°C熱水處理后進(jìn)行蛋白提取，提取液中存在蛋白聚糖，體外活性分析結(jié)果表明這些成分可保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，對(duì)抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎效果顯著[9]。燕窩經(jīng)過胰酶降解后的混合物中存在可顯著抑制流感病毒的組分，這些活性成分主要是多肽或糖肽類物質(zhì)[10]。這些研究表明燕窩經(jīng)過提取或降解處理后，不僅有利于吸收而且會(huì)表現(xiàn)出多種生物活性。因此，研究并建立燕窩低聚肽的制備工藝對(duì)于提高燕窩生物活性等具有重要意義。

采用不同的生物酶研究對(duì)燕窩中黏蛋白的降解行為，比較酶解前后燕窩蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成及唾液酸含量變化，并采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)燕窩低聚肽的生物學(xué)活性，為基于燕窩的深加工技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛燕窩由馬來西亞瑞瑪燕窩有限公司提供；胰蛋白酶購自北京格源天潤生物科技有限公司；胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶分別購自南寧龐博生物工程有限公司。刀豆蛋白A(ConA)購自美國Sigma試劑公司，CCK8試劑盒和乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。色譜純乙腈(ACN)及三氟乙酸(TFA)購自Merck 公司；其他試劑均為市售分析純。淋巴瘤細(xì)胞YAC-1購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

BALB/c雌性小鼠(6～8周齡)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

膠體磨購自廊坊市惠友機(jī)械有限公司；噴霧干燥機(jī)為瑞士Buchi公司B290。HPLC為美國Agilent 1260系統(tǒng)，離子阱質(zhì)譜(LCQ DecaXP)和三重四級(jí)桿質(zhì)譜(TSQ)均為美國Thermo公司儀器，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和分析軟件分別為Xcalibur1.3 和Biowroks3.1，凝膠過濾色譜柱TSk 2000SW購自Tosoh公司。

1.3 燕窩低聚肽制備方法

1)清洗：取100.0 g毛燕窩加入1 L去離子水，浸泡3.0 h后過濾，使用2.0 L去離子水清洗2次。2)粉碎：將毛燕窩懸浮在1.5 L去離子水中，使用膠體磨將毛燕窩打成漿狀。3)酶解：將毛燕窩漿裝入2.0 L的玻璃反應(yīng)釜中，將加入1.0 mol/L的Na2CO3將pH值調(diào)至8.0，將夾套溫度調(diào)至38℃，按照燕窩∶酶=100∶1的質(zhì)量比例加入胰蛋白酶(250 U/mg)，攪拌速率控制在120.0 r/min。在酶解過程中分時(shí)取樣。4)固液分離：將酶解產(chǎn)物使用300目濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集透過液，將透過液在10 000 r/min條件下進(jìn)行離心5 min，收集上清液。5)噴霧干燥：進(jìn)風(fēng)溫度195.0℃，出口溫度100.0℃，進(jìn)風(fēng)氣流量，5.0 m3/min。將酶種類分別更換為胃蛋白酶(250 U/mg)、堿性蛋白酶(250 U/mg)和中性蛋白酶(200 U/mg)并將溶液調(diào)至合適的pH值條件，按照燕窩∶酶=100∶1的質(zhì)量比例加入燕窩漿中，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析方法

1)氨基酸組成分析。采用2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生的方法對(duì)燕窩中的氨基酸組成進(jìn)行分析。氨基酸高效液相色譜分離條件，色譜柱：Zorbax C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L 乙酸鈉水溶液，B為50%乙腈水溶液(V/V)；梯度：0～15 min，30%～55% B，15～25 min，55%～100% B，25～35 min，100%～30% B，35～45 min，30% B保持10 min；流速：0.5 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：32.0℃；上樣量5.0 μL。毛燕和燕窩肽的氨基酸組成分析方法參照文獻(xiàn)[11]。2)分子量范圍測定。凝膠過濾色譜法(HPSEC)分析，色譜柱：TSK2000SW(300 mm × 7.5 mm I.D.,10 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比)；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL。參照國家標(biāo)準(zhǔn)[12]中的方法。3)唾液酸含量分析。采用鄰苯二胺鹽酸鹽衍生化法測定燕窩中的唾液酸含量。唾液酸高效液相色譜分離條件，色譜柱：Zorbax C18(3.0×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=18∶85(體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。參照文獻(xiàn)[13]中的方法。4)LCQ質(zhì)譜測定方法。色譜柱：Zobarx SB C18(150×2.1 mm I.D．，5 μm)；流動(dòng)相A：水(含0.1% TFA)，B：乙腈(0.1% TFA)；梯度：0～90 min，5%～80%B；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源噴霧電壓4.5 kV，加熱電壓15.0 V，離子導(dǎo)入電壓-20.0 V，殼氣流速：60.0 arb，輔助氣流速：5.0 arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度：300.0℃。

1.5 功效評(píng)價(jià)

1)小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性檢測。BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡)給予口服生理鹽水、燕窩和燕窩低聚肽進(jìn)行處理，正常成年人燕窩食用量4.5～9 g/d，實(shí)驗(yàn)以6～8周小鼠，體重20.0 g以上，每天喂食10.0 mg，相當(dāng)于成人每天食用4.5 g[14]，共14 d，于第15天取小鼠脾臟，于生理鹽水中研磨后，將脾細(xì)胞以5×104每孔種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入Con A(10 μg/mL)刺激48 h后，使用CCK8試劑盒測定淋巴細(xì)胞增殖活性[15-16]。2)小鼠NK細(xì)胞活性檢測。上述藥物處理小鼠脾細(xì)胞5×104與淋巴瘤細(xì)胞YAC-1 1×104種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板共培養(yǎng)4 h后，500.0 r/min離心取上清，以乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[17]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 燕窩酶解工藝研究

燕窩中能在常溫水中溶解的蛋白質(zhì)含量較低，浸泡過程中水溶液中幾乎檢測不出水溶性蛋白質(zhì)，將浸泡后的燕窩進(jìn)行膠體磨打漿處理后，溶液中僅釋放出少量分子量較低的蛋白質(zhì)(圖1)；將燕窩漿60℃加熱處理1 h后，溶液中逐漸釋放出水溶性蛋白質(zhì)，凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明這些釋放的主要蛋白質(zhì)分子量范圍80～100 ku，而低分子量水溶性蛋白質(zhì)的含量低于10%(圖1)。在60℃條件下將加熱時(shí)間延長至3 h，水溶性蛋白質(zhì)的總釋放量增加了300%，但分子量范圍幾乎沒有變化。

為了提高燕窩中的蛋白質(zhì)釋放量并加速蛋白質(zhì)酶解過程，實(shí)驗(yàn)首先使用了胰蛋白酶，將燕窩勻漿經(jīng)過60℃熱處理1 h后進(jìn)行酶解處理。在37℃下加入1%胰蛋白酶后攪拌處理1 h后上清液的凝膠過濾色譜圖，結(jié)果表明溶液中逐漸釋放出低分子量的多肽，根據(jù)色譜峰面積定量方法計(jì)算得到低分子量的多肽含量達(dá)到16%(圖2)；隨著酶解時(shí)間延長，溶液中低分子量多肽的比例逐漸升高；酶解2.0 h后溶液中多肽含量較酶解1 h的含量提高了3倍，雖然分子量范圍無顯著差異，但溶液中固形物含量大幅度下降。隨著酶解時(shí)間的延長，色譜圖中保留時(shí)間在11 min的組分含量逐漸降低，酶解3.0 h后溶液中燕窩幾乎全部被降解，肉眼觀察不到燕窩固形物，色譜圖中保留時(shí)間為11 min的組分含量不足5%，溶液中多肽的保留時(shí)間較酶解2 h的保留時(shí)間明顯右移，表明溶液中釋放出的蛋白質(zhì)逐漸被酶解為多肽；繼續(xù)延長酶解時(shí)間，色譜圖中酶解產(chǎn)物內(nèi)多肽的分子量繼續(xù)向右移動(dòng)，酶解4 h后溶液中逐漸形成了保留時(shí)間為24、27.5和30 min的分子量小于5 ku的低聚肽，與酶解3 h的溶液相比，保留時(shí)間為24 min的多肽逐漸被降解為保留時(shí)間為27.5和30 min的低聚肽。4 h后繼續(xù)延長酶解時(shí)間，多肽平均分子量有所下降，但保留時(shí)間為11 min組分的含量沒有顯著降低，可能是燕窩中存在一定量難以被降解的蛋白。

圖1 燕窩清洗后水溶液和熱處理后溶液凝膠過濾色譜圖Figure 1 Gel filtration chromatogram of washing solution of bird′s nest and the supernatant of thermo-heated bird′s nest

圖2 不同酶解時(shí)間條件下燕窩水解物凝膠過濾色譜圖Figure 2 Gel filtration chromatogram of tryptic digest of raw bird′s nest with different digest time

燕窩中蛋白質(zhì)含量在60%左右，文獻(xiàn)報(bào)道的燕窩蛋白質(zhì)主要是黏蛋白且糖基化程度較高[8]，在非變性條件下難以被酶解；為了便于酶解處理并提高酶解效率，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)燕窩進(jìn)行了熱變性處理。由于蛋白質(zhì)高溫條件下長時(shí)間熱變性處理易導(dǎo)致隨機(jī)降解，且在多糖存在的條件下易發(fā)生美拉德反應(yīng)并形成希夫堿等有色物質(zhì)，為此實(shí)驗(yàn)選擇了可促使蛋白變性并溶解的合適溫度。文獻(xiàn)報(bào)道60℃～80℃條件下部分蛋白質(zhì)可釋放，但部分蛋白質(zhì)在長時(shí)間(3～5 h)提取條件下方可得以釋放[18]，為此實(shí)驗(yàn)選擇了60℃作為預(yù)處理溫度。酶解過程中燕窩殘留量變化以及基于凝膠過濾色譜的分子量范圍分析結(jié)果表明，該條件可以制備出燕窩低聚肽。

為了研究不同蛋白酶對(duì)燕窩降解的影響，實(shí)驗(yàn)在相同的工藝條件下使用胃蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶等進(jìn)一步考察了脫毛燕窩的降解過程。圖3是不同條件下燕窩懸浮物中未降解燕窩的殘留量隨酶解時(shí)間的變化曲線。結(jié)果表明堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)燕窩的降解作用不顯著，酶解6 h后溶液中不溶物的殘留量仍高達(dá)40%以上；基于胃蛋白酶的燕窩降解速率顯著高于堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解3 h和4 h后固形物殘留量分別為18%和10%，但酶解速率顯著低于胰蛋白酶。另外，胃蛋白酶催化作用最適pH 2.5～3.0，反應(yīng)結(jié)束后需要加入大量的堿將溶液pH調(diào)至中性，導(dǎo)致獲得的低聚肽具有一定咸味，胰蛋白酶的最適pH 8.0，反應(yīng)結(jié)束后加入少量酸即可調(diào)至中性，可降低鈉的使用量。天然燕窩可在自然界長期存在而不被微生物降解，其可能原因是微生物分泌的酶難以有效降解燕窩中的黏蛋白。胰蛋白酶和胃蛋白等動(dòng)物來源的酶與微生物分泌的酶存在差異，圖3表明這些酶對(duì)燕窩中蛋白的降解效率高于微生物分泌的酶。實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶作為生物催化劑，進(jìn)一步考察了酶解后低聚肽粉的分子量范圍、氨基酸組成以及生物活性等。

圖3 酶解過程中燕窩降解曲線Figure 3 Degradation process of bird′s nest during enzymatic processing

2.2 燕窩酶解產(chǎn)物分析

對(duì)毛燕窩和燕窩低聚肽的氨基酸組成進(jìn)行了分析(表1)，毛燕窩18種氨基酸的含量為45.6%，經(jīng)過預(yù)處理和酶解后氨基酸含量提高到50.1%。雖然燕窩清洗過程會(huì)導(dǎo)致少量可溶性蛋白組分的流失，但也會(huì)導(dǎo)致燕窩中無機(jī)鹽含量大幅度降低；此外毛燕窩中還存在少量的羽毛和木屑等組分，酶解過程中這些組分難以被降解，酶解產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥后總氨基酸含量會(huì)有所提高。

表1 燕窩及其低聚肽氨基酸組成分析結(jié)果Table 1 Amino acid compostion of bird′s nest and tryptic digest

氨基酸組成分析結(jié)果中含量較高的依次為天冬氨酸(含天冬酰胺)、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸和絲氨酸等。燕窩中含有大量的唾液黏蛋白，唾液黏蛋白屬于糖蛋白，該類蛋白質(zhì)中N-連接的糖基化位點(diǎn)主要發(fā)生在天冬酰胺，O-連接的糖基化位點(diǎn)主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸[19]。毛燕窩中氨基酸組成分析結(jié)果中天冬氨酸(含天冬酰胺)、絲氨酸和蘇氨酸的含量分別高達(dá)4.3%、3.6%和3.9%，唾液黏蛋白屬高糖基化蛋白，尤其是N-連接的糖鏈含量較高，氨基酸組成分析結(jié)果與唾液黏蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)較為對(duì)應(yīng)。毛燕窩中甲硫氨酸的含量極低，唾液黏蛋白中蛋氨酸含量較低，進(jìn)一步證明了燕窩提取物中含有大量唾液黏蛋白。

雨燕科動(dòng)物中識(shí)別出的蛋白質(zhì)數(shù)量有限，實(shí)驗(yàn)利用液質(zhì)聯(lián)用與多肽檢測相結(jié)合的技術(shù)從燕窩蛋白的酶解產(chǎn)物中檢索出多肽FVSNTTLK，由于目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中雨燕的蛋白質(zhì)較少，實(shí)驗(yàn)采用序列檢索方法檢索了含有該序列的其他動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)，檢索結(jié)果表明數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)A6P6W2_COTJA(鵪鶉)、F1NG99-CHICK(雞)、G1NAI9-MELGA(火雞)、H0ZEE4-TAEGU(雀)中均含有序列FVSNTTLK等，實(shí)驗(yàn)采用相同的分析方法從燕窩中識(shí)別出20種不同類型的蛋白質(zhì)，識(shí)別結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)采用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析了酶解后低聚肽的分子量(圖4)。經(jīng)過MALDI-TOF分析得到的燕窩蛋白的分子量與文獻(xiàn)中報(bào)道的燕窩分子量約為60 ku一致[20]。酶解后的燕窩分子量較低，豐度較高的低聚肽的質(zhì)荷比主要集中在1～6 ku，其中2～4 ku范圍內(nèi)較為集中，在MADLI-TOF中低聚肽主要以單電荷形式存在，與基于凝膠過濾色譜的分子量范圍檢測結(jié)果吻合。

表2 燕窩中識(shí)別出的不同類型寡肽Table 2 Different kinds of peptides identified from bird′s nest

注:a為匹配程度+<++<+++

圖4 燕窩低聚肽的飛行時(shí)間質(zhì)譜圖Figure 4 Time of flight mass spectra of tryptic digest of bird′s nest

燕窩中主要功效成分是唾液酸，實(shí)驗(yàn)測定了毛燕窩和燕窩低聚肽中唾液酸的含量，其中毛燕窩中唾液酸的含量為11.6%，經(jīng)過酶解處理后含量升至14.3%。由于毛燕窩中存在一定量的毛發(fā)、木屑等雜物，含水量約10.0%，酶解處理后的溶液經(jīng)過過濾后會(huì)除去不溶物以及少量的無機(jī)鹽，噴霧干燥后的低聚肽含水量降低5.0%，因此唾液酸的含量有所上升。

表3 燕窩及其低聚肽唾液酸含量分析結(jié)果Table 3 Sialic acid contents in bird′s nest and oligopeptides

圖5燕窩及低聚肽增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖效果
Figure 5 Effect of bird′s nest and its digest mixture on proliferation of T-cell

圖6 燕窩及低聚肽增強(qiáng)抑制NK細(xì)胞活性效果Figure 6 Effect of bird′s nest and its digest mixture inhibition of NK cell activity

2.3 酶解產(chǎn)物生物活性分析

實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組分別喂食燕窩、燕窩多肽，對(duì)照組喂食生理鹽水，每組5只小鼠，喂食14 d后，分別取小鼠脾臟，研磨后檢測樣品對(duì)T細(xì)胞增殖能力和抑制NK細(xì)胞活性的影響，細(xì)胞測定重復(fù)5次，每組的檢測結(jié)果取平均值，檢測結(jié)果見圖5和圖6。結(jié)果表明，口服無明顯毒副作用的大劑量燕窩和燕窩肽顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞反應(yīng)性。Spleen cell+ConA培養(yǎng)48 h后CCK8細(xì)胞檢測增殖活性，結(jié)果表明燕窩多肽組與對(duì)照組及燕窩組相比，增殖活性顯著增高(P<0.05)，說明燕窩低聚肽能使ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖并且增殖效果高于燕窩。將Spleen cell+YAC-1 cell培養(yǎng)4 h后取上清檢測溶液中乳酸脫氫酶釋量，結(jié)果表明對(duì)照組YAC細(xì)胞死亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，即實(shí)驗(yàn)組對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制效果顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組中燕窩和燕窩多肽組之間對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制效果無明顯差異(P>0.05)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在刺激淋巴細(xì)胞增殖方面燕窩和燕窩低聚肽顯著強(qiáng)于對(duì)照組，其中燕窩低聚肽的效果最強(qiáng)；在抑制NK細(xì)胞活性方面，實(shí)驗(yàn)組抑制效果強(qiáng)于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組之間無顯著差異。這表明經(jīng)過酶解處理的燕窩低聚肽能夠顯著提高免疫細(xì)胞的免疫活性。

3 結(jié)論

本研究首先考察了酶解時(shí)間對(duì)燕窩酶解效果的影響。結(jié)果表明，燕窩經(jīng)60.0℃熱變性處理后可通過胰蛋白酶和胃蛋白酶有效降解，酶解處理4 h燕窩降解率分別達(dá)到96.0%和91.0%，堿性蛋白酶和中性蛋白酶可部分降解燕窩，4 h后殘留量分別為40.0%和36.0%。因此，胰蛋白酶可用于燕窩低聚肽制備的制備，而現(xiàn)有文獻(xiàn)中研究燕窩低聚肽酶解條件的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)對(duì)燕窩產(chǎn)物的氨基酸組成、分子量及生物活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，燕窩酶解產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥后總氨基酸含量有所提高，并進(jìn)一步證明了燕窩提取物中含有大量唾液黏蛋白。分子量分析結(jié)果表明燕窩蛋白與文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白分子量較為一致。酶解后燕窩低聚肽分子量主要集中在2～4 ku?；钚苑治鼋Y(jié)果表明，燕窩低聚肽對(duì)T細(xì)胞的增殖效果顯著高于燕窩并且可顯著抑制NK細(xì)胞的活性，證明經(jīng)過酶解處理的燕窩低聚肽可顯著提高燕窩對(duì)免疫的提升能力。