蛛絲蛋白PySp用于靜電紡纖維膜的研究

沈慶春，米俊鵬，田露陽，莫秀梅，孟 清

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

蜘蛛絲有著強(qiáng)度高、柔韌性好、質(zhì)地輕、可降解、高溫耐受性及生物相容性好等特性，綜合性能遠(yuǎn)超桑蠶絲，KEVLAR及目前最好的纖維制品，在材料、軍工、紡織和建筑等領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[1-4]。至今國內(nèi)外尚未有一家科研單位可以仿生接近天然蛛絲性能的人造蛛絲纖維，嚴(yán)重阻礙了這種新型優(yōu)良材料的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

大腹圓蛛是我國的主要蜘蛛品種，擁有7種絲腺，相應(yīng)的能產(chǎn)生7種不同特性的纖維及蛛絲相關(guān)蛋白，各具有不同的生物學(xué)和材料學(xué)功能[2]。在大腹圓蛛的7種絲腺中，梨狀腺體產(chǎn)生梨狀腺絲蛋白(PySp)，是一種強(qiáng)力膠，用于固定蛛絲，確保蛛絲與靶子穩(wěn)定連接，在蜘蛛獲取獵物時(shí)也至關(guān)重要[5]。

在組織工程領(lǐng)域，靜電紡納米纖維能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，為細(xì)胞生長提供所需要的外部環(huán)境[6]；在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，力學(xué)性能優(yōu)異，生物相容性好的靜電紡材料在組織再生與修復(fù)領(lǐng)域中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。基于靜電紡的各種優(yōu)勢，靜電紡在組織支架或傷口敷料[7-8]、小口徑人造血管[9]等方面有著廣泛的研究。但迄今為止，國內(nèi)外很少有研究機(jī)構(gòu)使用蜘蛛絲進(jìn)行相關(guān)材料學(xué)研究。

不同的蛛絲蛋白具有不同的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，不同的蛛絲的性能與品質(zhì)基本由重復(fù)結(jié)構(gòu)域Rep所決定[10-12]。所以，為了更好地研究蜘蛛梨狀腺絲蛋白的應(yīng)用價(jià)值，我們以表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的大腹圓蛛PySp完整重復(fù)區(qū)(Rep)基因?yàn)榈鞍撞牧?，利用靜電紡絲探究合適的紡絲條件，得到合適的納米纖維膜，利用SEM觀察納米纖維膜表面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部絲直徑和表面性狀；利用紅外光譜研究纖維膜二級(jí)結(jié)構(gòu)；接觸角測試研究纖維膜親水性；熱重分析研究蛋白纖維膜熱力學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步獲得具有優(yōu)異力學(xué)性能的人工蛛絲蛋白納米纖維材料提供研究方向和可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

重組梨狀腺絲蛋白；六氟異丙醇(HFIP，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司)；靜電紡絲裝置(自制)；高壓靜電發(fā)生器(上海仰光電子科技有限公司)；掃描電子顯微鏡Phenom XL(美國飛納)；NEXUS-670型傅里葉變換紅外-拉曼光譜儀(美國Nicolet公司)；接觸角分析儀DSA30(德國Kruss公司)；熱重分析儀TG209F1(德國NETZSCH公司)。

1.2 靜電紡絲與納米纖維膜特性測定

1.2.1 紡絲液的配制

將一定質(zhì)量的蛛絲蛋白溶于六氟異丙醇(HFIP)中,過夜攪拌至透明，得到不同質(zhì)量體積比的紡絲溶液。

1.2.2 靜電紡納米纖維的制備

將紡絲液注入2.5 mL的注射器中，注射器的金屬針頭內(nèi)徑為0.65 mm，靜電高壓發(fā)生器和針頭通過電線和一個(gè)鐵夾連接起來，將包有鋁箔的方形板作為接收器接收靜電紡纖維，并通過地線接地。通過實(shí)驗(yàn)摸索，靜電紡工藝參數(shù)為電壓：10～14 kV；接收距離：10～15 cm；給液速率：0.6～1.0 mL/h。

1.2.3 納米纖維膜交聯(lián)

將得到的均勻的納米纖維膜放入75%乙醇蒸氣中過夜交聯(lián)，然后將交聯(lián)后纖維膜放入真空干燥箱中干燥。

1.2.4 納米纖維形貌表征

將靜電紡纖維試樣噴金60 s，然后在10 kV加速電壓下，用Phenom XL型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察纖維的形態(tài)。根據(jù)所得的SEM圖像，對蛛絲蛋白纖維膜表面微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。

1.2.5 紅外光譜測試

將交聯(lián)并干燥和未經(jīng)交聯(lián)的蛋白納米纖維膜，利用NEXUS-670型衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜法ATR-FTIR進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)測定，并對比兩者的差別，波長范圍為600～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.6 熱重分析(Thermogravimetric analysis,TGA)

將待測樣品剪碎，稱重，裝入坩堝中壓緊，用TG209F1型熱重分析儀對其進(jìn)行熱重分析。N2為氛圍，升溫速率為10℃/min，溫度范圍為10℃～600℃。

1.2.7 親疏水測試

將0.03 mL去離子水滴在靜電紡納米纖維膜上，觀察液滴在納米纖維膜上的狀態(tài)，并實(shí)時(shí)錄像，對接觸后2、4和6 s后的狀態(tài)進(jìn)行記錄，得出其親疏水性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜電紡蛛絲蛋白PySp納米纖維膜SEM結(jié)果分析對比

在靜電紡的過程中，我們發(fā)現(xiàn)在12 kV的電壓下，當(dāng)蛛絲蛋白PySp濃度為2.5%(W/V)時(shí)(圖1-A)，視野中僅出現(xiàn)少量帶有液珠的纖維；當(dāng)濃度增加到5%時(shí)(圖1-B)，情況相對2.5%(W/V)時(shí)變化不大，纖維依舊附著有液珠。可以推測，在12 kV的情況下，濃度太小，基本無法形成纖維。當(dāng)濃度為12%(W/V)時(shí)(圖1-C)，視野中只有不多的纖維，且短細(xì)，有大量液珠在絲纖維上；當(dāng)濃度為15%(W/V)時(shí)(圖1-D)，有光滑的絲纖維形成，但是數(shù)量不多；當(dāng)濃度為18%(W/V)時(shí)(圖1-E)，有相對大量的絲纖維形成，絲纖維上有明顯的結(jié)點(diǎn)；當(dāng)濃度為20%(W/V)時(shí)(圖1-F)，視野中有大量且密集的絲纖維形成。在相對低電壓下(12 kV)，隨著濃度的增加，蛛絲純蛋白的成絲質(zhì)量在變好，同時(shí)，證明了純蛛絲蛋白的可紡性。之后，增大電壓，在14 kV的電壓，8%的濃度下，靜電紡得到光滑致密，分布均勻的靜電紡蛛絲纖維膜(圖1-G)，以及經(jīng)75%乙醇蒸氣交聯(lián)的纖維膜(圖1-H)。從圖中可以看出，經(jīng)過交聯(lián)的纖維膜變得更加致密了。

2.2 靜電紡蛛絲蛋白PySp納米纖維膜紅外光譜測定

紅外光譜(ATR-FTIR)是測量分子間相互作用的有效工具，其酰胺峰的位置和強(qiáng)度能反映出蛋白質(zhì)的構(gòu)象。蛋白纖維膜主要觀察紅外光譜的酰胺Ⅰ帶[13]。如圖2-A，a為交聯(lián)前紅外光譜圖，酰胺Ⅰ帶在1652 cm-1有強(qiáng)吸收峰，說明未經(jīng)75%乙醇蒸氣交聯(lián)的纖維膜蛋白構(gòu)象主要是α螺旋；而如圖2-A，b為交聯(lián)后紅外光譜圖，在1625 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，可見經(jīng)過75%乙醇蒸氣交聯(lián)的蛋白纖維膜為β折疊。說明75%乙醇蒸氣交聯(lián)改變了蛋白纖維膜的構(gòu)象。

A:12 kV電壓，2.5%濃度;B:12 kV電壓，5%濃度;C:12 kV電壓，12%濃度;D:12 kV電壓，15%濃度;E:12 kV電壓，18%濃度;F:12 kV電壓，20%濃度;G:14 kV電壓，8%濃度;H:14 kV電壓，8%濃度。 交聯(lián)后比例尺A～F為20 μm，G和H為5 μm

圖1靜電紡蛛絲蛋白纖維
Figure 1 Spidroin silk fiber by electrospinning

2.3 熱重(TGA)結(jié)果分析

熱失重是測量物質(zhì)熱穩(wěn)定性較為常用的方法。通過熱失重曲線可知材料隨溫度升高時(shí)的分解溫度、分解速度及分解程序。從圖2-B中可以看出，交聯(lián)前納米纖維在溫度升高的初期，在很短的溫度范圍中失重較快，之后失重較慢，中期失重較快，后期又趨于平穩(wěn)。交聯(lián)后趨勢與交聯(lián)前相似，失重速度更快，最終總的失重為71.1%，較交聯(lián)前的59%，失重更多[14]。這表明，交聯(lián)后的蛋白納米纖維熱穩(wěn)定性比交聯(lián)前的相對低。

A:靜電紡蛛絲納米纖維紅外譜圖,其中a為交聯(lián)前紅外譜圖，b為交聯(lián)后紅外譜圖；B：蛋白納米纖維熱失重曲線，其中 a為交聯(lián)后曲線，b為交聯(lián)前曲線

圖2紅外譜圖與熱重分析圖
Figure 2 ATR-FTIR spectra and TG analysis

A：液滴剛接觸纖維膜；B：2 s時(shí)的狀態(tài)；C：4 s時(shí)的狀態(tài) ；D：6 s時(shí)的狀態(tài)

圖3接觸角分析圖
Figure 3 Water contact angles of spidroin fiber membrane

2.4 親疏水測試

生物材料的親疏水性是材料的一項(xiàng)重要性能指標(biāo)，直接影響著材料的吸附、表面細(xì)胞的黏附、增殖和遷移[15]，其通常利用接觸角測試來確定。我們利用交聯(lián)后的纖維膜作為親疏水測試材料。液滴從接觸纖維膜到6 s后的狀態(tài)如圖3,可以看到當(dāng)液滴接觸到纖維膜上時(shí)，6 s內(nèi)，便完全沒入纖維膜中。說明納米纖維膜有良好的親水性[16]。

3 討論

靜電紡對于聚合物分子量大小有一定的要求，故我們首先以一定的電壓(12 kV)測試PySp蛋白的可紡性。從掃描電鏡圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，從2.5%(W/V)開始，發(fā)現(xiàn)成絲量較少，且液珠過多，故增加蛋白含量，至20%(W/V)，發(fā)現(xiàn)成絲量滿足要求但因?yàn)闈舛冗^大，導(dǎo)致纖維直徑過大，部分達(dá)到1000 nm甚至1500 nm以上，且絲纖維直徑長度分布不均，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)有影響。之后嘗試增加電壓為14 kV，在8%(W/V)濃度下得到較為合適的蛋白絲纖維。在交聯(lián)前后，絲纖維直徑有明顯增大，這應(yīng)該是因?yàn)榈鞍讟?gòu)象發(fā)生變化導(dǎo)致的。在紅外光譜圖中，顯示蛋白纖維膜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過交聯(lián)前后紅外光譜的對比，驗(yàn)證了掃描電鏡中的觀察結(jié)果，在紅外光譜的酰胺Ⅰ帶中，可以發(fā)現(xiàn)交聯(lián)前在1652 cm-1，交聯(lián)后在1625 cm-1，有強(qiáng)吸收峰，表明蛋白構(gòu)象因?yàn)?5%乙醇蒸氣發(fā)生了相對完全的改變，整體從α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B。構(gòu)象的改變使得蛋白纖維膜不溶于水，強(qiáng)度增強(qiáng)，且不易氧化分解[13]，對于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)以及同類的研究有比較大的意義。在熱失重分析試驗(yàn)中，從10℃到600℃的升溫范圍中可以看出，交聯(lián)后的纖維膜的熱穩(wěn)定性不及交聯(lián)前，這可能是因?yàn)闃?gòu)象的改變所導(dǎo)致的。熱失重的結(jié)果表明，纖維材料的工作溫度需要在失重較大的溫度以下，也為之后的實(shí)驗(yàn)提供借鑒，可以嘗試運(yùn)用其他物理化學(xué)或生物化學(xué)的方法提升纖維膜的熱穩(wěn)定性。綜合以上測試，交聯(lián)后纖維膜具有更好的綜合性能。親水性實(shí)驗(yàn)中，我們可以發(fā)現(xiàn)，蛋白纖維膜的親水性是相當(dāng)優(yōu)秀的，完全是一種親水材料，這對于應(yīng)用于組織工程有較大的用處，將提升細(xì)胞、組織的黏附性質(zhì)。

本次研究首次實(shí)現(xiàn)大腹圓蛛梨狀腺絲PySp蛋白的組織工程應(yīng)用。采用靜電紡絲方法實(shí)現(xiàn)纖維膜的制備，并對纖維膜的各項(xiàng)性質(zhì)進(jìn)行了測試，確定了交聯(lián)后的納米纖維膜具有更好的綜合性能，對靜電紡蛛絲蛋白纖維膜有了更加深入的認(rèn)識(shí)，將給之后蛛絲蛋白領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用帶來啟示。同時(shí)，因?yàn)橹虢z蛋白優(yōu)良的生物相容性并具有一定的力學(xué)性能，可將蛛絲蛋白與其他合成材料通過一定的方式混合，得到各方面更為優(yōu)秀的合成材料，為人工蛛絲蛋白在生物材料應(yīng)用上提供了新的可能。