魚明膠提取及其品質(zhì)影響因素

李雙，涂宗財(cái)，陳雪嵐

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

明膠是一種無脂肪的高蛋白，不含膽固醇的天然營養(yǎng)型食品添加劑。明膠作為一種強(qiáng)有力的保護(hù)膠體，具有較強(qiáng)的乳化力，能有效抑制牛奶、豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)入胃后因胃酸作用而引起的凝聚反應(yīng)，有利于提高食物消化能力。除了在食品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用外，明膠在醫(yī)藥、化妝品、照相等領(lǐng)域因其具有良好的凝膠性、成膜性、持水性及起泡性等特點(diǎn)亦發(fā)揮著特殊的功能。目前，工業(yè)上應(yīng)用的明膠大部分來源于哺乳動(dòng)物，如豬皮、牛皮、豬骨、牛骨等。但近年瘋牛病和口蹄病等哺乳動(dòng)物傳染疾病的肆意傳播，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物明膠的安全性受到廣大消費(fèi)者的普遍質(zhì)疑；另因宗教信仰(如伊斯蘭教、印度教飲食禁忌)等原因使得哺乳動(dòng)物明膠在某些食品中的應(yīng)用亦受到一定限制。

因此開發(fā)非哺乳動(dòng)物來源的明膠具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著魚類直接食用和加工量的不斷增加，尤其是我國淡水水產(chǎn)品產(chǎn)量居世界第一，其加工過程中產(chǎn)生了大量的廢棄物—皮、骨、鱗，而這些廢棄物實(shí)際上含有大量的膠原蛋白，可作為明膠的主要來源，因此近年對(duì)其的深加工研究受到越來越多的科技工作者關(guān)注。

雖然近幾十年來魚明膠的研究非常普遍，但由于其產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系使其還不能完全替代哺乳動(dòng)物明膠，提高魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)是擴(kuò)大其應(yīng)用前景的重要研究方向。魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)受原材料及其保存方式、提取方法、提取溫度及提取時(shí)間等因素的影響。傳統(tǒng)上，魚明膠的提取步驟一般分為四步：(1)除去原材料中非膠原蛋白雜質(zhì)；(2)預(yù)處理使膠原蛋白溶脹，提高提取效率；(3)熱水解萃取明膠；(4)將所得明膠干燥、保存[1]。魚明膠按其預(yù)處理方式不同分為2種提取方法，即化學(xué)提取法(酸堿試劑)和酶法。化學(xué)提取法即用酸或堿試劑破壞魚膠原蛋白的非共價(jià)鍵，隨后熱激使膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂導(dǎo)致螺旋-線圈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，斷裂氫鍵和共價(jià)鍵，使其轉(zhuǎn)化為可溶性膠原。膠原的膨脹和溶解與酸堿的類型和濃度極其相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致所得明膠的分子質(zhì)量分布不同，影響明膠的品質(zhì)；該法還存在生產(chǎn)周期過長(zhǎng)、酸堿殘留等缺陷。酶法即用蛋白水解酶(如中性蛋白酶、胃蛋白酶和膠原酶等)提取明膠，酶法克服了酸堿的類型和濃度的局限性，且具有生產(chǎn)周期短、提取量高、污染少等優(yōu)點(diǎn)；但存在常用的酶的專一性不夠高且可能會(huì)產(chǎn)生苦味肽的問題。采用以上傳統(tǒng)方式獲得的魚明膠與哺乳動(dòng)物明膠相比其流變學(xué)性質(zhì)、凝膠強(qiáng)度等品質(zhì)都較低，導(dǎo)致其市場(chǎng)需求較低。若想擴(kuò)大魚明膠的應(yīng)用，急需對(duì)魚明膠傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行創(chuàng)新以提高魚明膠的品質(zhì)。近年來，相關(guān)科研工作者研究了不同來源的魚明膠的特點(diǎn)及不同保存方法對(duì)其品質(zhì)的影響；優(yōu)化魚明膠提取時(shí)間、溫度；外添加糖和鹽、用酶抑制劑結(jié)合蛋白酶處理提高明膠品質(zhì)等方法；并在傳統(tǒng)預(yù)處理方法上進(jìn)行革新，如用超聲波、高壓輔助酸堿試劑提取明膠及酶修飾等方式提高產(chǎn)量的同時(shí)獲得更好品質(zhì)的魚明膠。

本文對(duì)影響魚明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的因素、提取條件的優(yōu)化和提取方法的革新進(jìn)行了總結(jié)，以期為相關(guān)科研工作者進(jìn)一步提高魚明膠產(chǎn)量及其品質(zhì)、擴(kuò)大魚明膠的應(yīng)用前景提供參考和理論依據(jù)。

1 影響明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的因素

1.1 魚類的來源對(duì)明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

魚類的生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)影響魚類體內(nèi)氨基酸分布、膠原蛋白結(jié)構(gòu)等從而影響魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)。GMEZ-GUILLéN等[2]研究了不同生活環(huán)境的海洋生物：溫帶海域的比目魚類(Lepidorhombusboscii、Soleavulgaris、Gadusmorhua)、冷水魚鱈魚(MerlucciusmerlucciusL.)和無脊椎動(dòng)物魷魚(Dosidicusgigas)中提取明膠并研究了凝膠性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同在45 ℃提取明膠時(shí)，其產(chǎn)率分別為：8.3%～7.4%、7.2%～6.5%和0。魷魚在45 ℃時(shí)沒有提取到明膠，當(dāng)溫度升至80 ℃其產(chǎn)量也只有2.6%，究其原因是魷魚膠原蛋白的溶解度很低，導(dǎo)致明膠難以提取且提取到的明膠凝膠強(qiáng)度最低。

凝膠強(qiáng)度是由氨基酸的組成及α-鏈、β-鏈的含量共同確定的復(fù)雜功能，是明膠最重要的功能性質(zhì)之一。復(fù)性明膠中三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與吡咯烷亞氨酸的總含量成正比，因?yàn)樗钣锌赡茉诔珊藚^(qū)域中形成脯氨酸和羥脯氨酸富集區(qū)域，羥脯氨酸含有-OH，丙氨酸和脯氨酸通常以Gly-pro-Y的形式存在于非極性區(qū)，這對(duì)維持魚明膠的三螺旋結(jié)構(gòu)有重要作用，且高含量的脯氨酸、羥脯氨酸和丙氨酸使明膠具有更高的粘彈性[3]。溫水魚中有高含量的α-鏈、丙氨酸及亞氨酸，故而具更高的凝膠強(qiáng)度和粘彈性，冷水魚則相反。分析魷魚明膠組成發(fā)現(xiàn)其羥脯氨酸的含量最高，但凝膠強(qiáng)度最低，其原因可能是80 ℃高溫提取破壞了α-鏈，同時(shí)魷魚中丙氨酸的含量非常低，會(huì)表現(xiàn)出一定的疏水性，且其賴氨酸羥基化水平非常高，而羥賴氨酸氧化脫氨的-NH2基團(tuán)會(huì)穩(wěn)定共價(jià)交聯(lián)作用，導(dǎo)致明膠提取量低，這正是低溶性膠原的特點(diǎn)。

魚明膠的凝膠性能很大程度受原材料的來源和種類影響，這與不同物種膠原中脯氨酸和羥脯氨酸含量差異有關(guān)。冷水魚皮膚的明膠由于其亞胺酸含量和脯氨酸羥基化程度相對(duì)低，其熱收縮性、變性溫度和明膠的熔融溫度明顯低于溫血?jiǎng)游锖蜕钤跍嘏蛑械聂~類[2]。溫水魚皮膚結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維狀纖維強(qiáng)，耐高溫環(huán)境，因此需要更苛刻的提取條件才能獲得更高的產(chǎn)量；但其擁有更高的熔融溫度，凝膠會(huì)保持更長(zhǎng)的時(shí)間，添加至食品中可提供更好的口感。因此，要根據(jù)不同來源的魚類的特點(diǎn)決定采用何種方法進(jìn)行提取及通過魚類來源判斷可能獲得的魚明膠產(chǎn)量和品質(zhì)。這可為生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。

1.2 不同保存方法對(duì)魚明膠品性的影響

目前，魚明膠原材料的保存方法一般為冷凍和干燥法。冷凍的溫度、干燥的方式都對(duì)魚明膠的品質(zhì)產(chǎn)生影響。FERNNDEZ-DAZ[4]比較研究了-12 ℃、-20 ℃冷凍保存方法對(duì)比目魚魚皮明膠品性影響，發(fā)現(xiàn)冷凍(-12和-20 ℃)保存的魚明膠中的α-鏈含量非常高，但β-及γ-鏈的含量很低，推測(cè)冷凍過程中形成的冰晶會(huì)損傷組織，且冷凍會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚合，形成更多共價(jià)交聯(lián)的膠原蛋白，使β-和γ-鏈以及高分子質(zhì)量聚合物的溶解和提取變得更困難，而小的膠原蛋白組分提取更容易。以上結(jié)果表明，冷凍保存的明膠各方面的品質(zhì)，包括凝膠溫度及融膠溫度等都相對(duì)較差，不適合作為魚明膠原材料的保存方法。

為尋找較理想的魚皮明膠原材料的保存方法，LIU等[5]比較了新鮮、干燥和冷凍(-18 ℃，3個(gè)月)3種不同方法保存斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctaus)魚皮明膠對(duì)其品性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種明膠凝膠、融膠溫度沒有顯著差異，但SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)干燥魚皮明膠的α-鏈、β-鏈都顯著高于新鮮魚皮明膠。α-鏈(α-鏈之間的交聯(lián)比其他組分之間的交聯(lián)更穩(wěn)定)含量與凝膠強(qiáng)度之間存在線性關(guān)系，理論上干燥魚皮明膠含有更多α-鏈表明其具有更高的凝膠強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，3種不同方法保存的魚皮在10 ℃過夜成熟之后，干燥明膠凝膠強(qiáng)度最高，達(dá)到256g；而新鮮和冷凍保存法提取的明膠強(qiáng)度分別為243 g和246 g。說明工業(yè)上使用干燥法保存魚皮以提取明膠是切實(shí)可行的。

為探明不同干燥法對(duì)魚皮明膠品質(zhì)的影響，GIMéNEZ[6]采用不同干燥法對(duì)多佛比目魚(Soleavulgaris)皮明膠品性的影響進(jìn)行了研究。干燥的方法分別是用乙醇、乙醇-甘油混合物和海鹽風(fēng)干魚皮，并在室溫下保存160 d。在儲(chǔ)存期間定期提取明膠，根據(jù)分子質(zhì)量分布，黏彈性，膠凝和熔融溫度以及凝膠強(qiáng)度評(píng)價(jià)明膠品質(zhì)。結(jié)果顯示，所有的干燥保存法對(duì)所評(píng)價(jià)的明膠品質(zhì)幾乎相同，對(duì)分子質(zhì)量分布、黏彈性和凝膠強(qiáng)度沒有顯著影響；盡管干燥保存法使得所得明膠黏彈性、膠凝溫度和融點(diǎn)有輕微降低，但在整個(gè)儲(chǔ)存期間其大部分蛋白質(zhì)均保持穩(wěn)定，說明不同的干燥保存法幾乎不影響明膠的品質(zhì)。因此，干燥保存法是生產(chǎn)實(shí)踐中的首選方法，不僅成本相對(duì)低廉而且魚皮明膠的品質(zhì)保持良好。

1.3 提取溫度和時(shí)間對(duì)明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

通常溫度提高和提取時(shí)間的延長(zhǎng)有利于提高明膠的產(chǎn)量，原因是當(dāng)施加較高的熱量時(shí)，天然膠原蛋白中的α-鏈之間的結(jié)合不穩(wěn)定，三螺旋結(jié)構(gòu)變得無定形；增加提取時(shí)間亦提供了更多的能量來破壞鍵能，從皮膚中釋放更多游離的α-和β-鏈，使明膠更容易提取，獲得更高的產(chǎn)率。如SINTHUSAMRAN等[7]分別在45 ℃和55 ℃時(shí)用不同提取時(shí)間(3、6和12 h)提取石斑魚(Latescalcarifer)魚皮明膠，結(jié)果顯示溫度高、時(shí)間長(zhǎng)回收率高，55 ℃明膠的回收率(62.0%～66.4%)顯著高于45 ℃的回收率(51.6%～57.3%)。點(diǎn)紋斑竹鯊和黑鰭鯊皮明膠[8]也有明膠產(chǎn)量隨著提取時(shí)間和溫度升高而提高的報(bào)道，但提取溫度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)均對(duì)魚明膠的品性有影響。

明膠具有高含量的α-、β-和γ-鏈會(huì)擁有更好的功能特性，包括凝膠性、起泡性和乳化性[6]。SINTHUSAMRAN等[7]通過SDS-PAGE和顯微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)45 ℃提取3 h的明膠α-、β-和γ-鏈含量最高，明膠基質(zhì)緊密排列，形成了最好的凝膠網(wǎng)絡(luò)，故凝膠強(qiáng)度最好可達(dá)369 g，高于牛明膠的208 g。溫度的提高、提取時(shí)間的延長(zhǎng)將導(dǎo)致明膠的α-、β-和γ-鏈含量下降，凝膠網(wǎng)絡(luò)松散，不利于凝膠強(qiáng)度。

明膠的凝膠時(shí)間與低分子質(zhì)量肽的含量相關(guān)，低分子質(zhì)量肽的含量越高，明膠的凝固時(shí)間越長(zhǎng)。SINTHUSAMRAN等[7]在實(shí)驗(yàn)中即發(fā)現(xiàn)55 ℃長(zhǎng)時(shí)間提取的明膠需更長(zhǎng)時(shí)間才能凝膠，而45 ℃較短時(shí)間提取的明膠凝膠時(shí)間短。此外，明膠的提取溫度和時(shí)間對(duì)明膠凝膠后的顏色也有影響，較高溫度特別是長(zhǎng)時(shí)間的提取容易發(fā)生非酶促褐變反應(yīng)。顏色差異小且明亮透明的明膠，更適合應(yīng)用于食品等行業(yè)。

魚明膠熱提取過程中，提取時(shí)溫度和受熱時(shí)間的控制極為重要，雖然延長(zhǎng)提取時(shí)間和提高提取溫度均有利于膠原蛋白的降解從而提高明膠產(chǎn)量，但提取溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響明膠中α-、β-和γ-鏈的含量及分布，影響明膠的品質(zhì)。溫和條件下提取的明膠品質(zhì)更好，更符合商業(yè)明膠的要求，但其產(chǎn)量較低。因此，提取魚明膠的溫度和時(shí)間要進(jìn)行綜合考量。

1.4 紫外線對(duì)魚明膠品質(zhì)的影響

為延長(zhǎng)魚明膠的保存時(shí)間，紫外線殺菌處理是一種常用的方法。BHAT等[9]研究其對(duì)魚明膠的影響時(shí)有意外的收獲：將魚明膠樣品(干顆粒)分別暴露于UV照射30和60 min，照射樣品的凝膠強(qiáng)度發(fā)生了顯著的改善(對(duì)照：177.8 g；照射30 min：198.1 g；照射60 min：234.0 g)。究其原因是紫外線處理會(huì)增加明膠分子間的交聯(lián)作用。紫外線處理可提高羅非魚和哺乳動(dòng)物明膠凝膠強(qiáng)度亦有報(bào)道[10]。在明膠黏性方面，BHAT等[9]發(fā)現(xiàn)紫外光照射后的明膠粘性遠(yuǎn)低于對(duì)照組(對(duì)照組：0.11 Pa·s；照射30 min：0.01 Pa·s；照射60 min：小于0.01 Pa·s)；在熱穩(wěn)定性方面，紫外照射后的凝膠溫度和融膠溫度都沒有顯著變化，但熔化焓值顯著增加，這種增加可能歸因于UV誘導(dǎo)明膠交聯(lián)，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)的增強(qiáng)，因此需要更高的熔融能量。

UV照射可提高明膠分子間的交聯(lián)導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度提高，黏度顯著降低，熔化焓值顯著改變，表明紫外線輻射作為一種改善魚明膠品性的手段具有一定的應(yīng)用前景。

1.5 糖和鹽對(duì)魚明膠品質(zhì)的影響

魚明膠在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，而食品成分復(fù)雜，添加有多種輔料，尤其是糖和鹽。為了解食品中添加糖和鹽是否會(huì)影響魚明膠的理化性質(zhì)，SOW等[11]用鈉鹽和蔗糖分別處理羅非魚明膠溶液以研究這兩種添加劑對(duì)魚明膠結(jié)構(gòu)及凝膠強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，鈉鹽的加入不利于明膠的凝膠強(qiáng)度，如存儲(chǔ)時(shí)間為0 d時(shí)對(duì)照組和鹽處理組凝膠強(qiáng)度分別為(165±11)g和(137±7)g。究其原因，HAUG等[12]認(rèn)為Na+的添加會(huì)增加溶液的離子強(qiáng)度，這可能會(huì)產(chǎn)生短程靜電相互作用的篩選效應(yīng)導(dǎo)致α-鏈的靜電橋減少；CHOI等[13]認(rèn)為是Na+破壞明膠結(jié)構(gòu)中的氫鍵并干擾疏水相互作用所致。為進(jìn)一步探究鹽對(duì)魚明膠的影響原因，SOW等[11]通過傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)和原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)研究明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Na+的加入會(huì)導(dǎo)致明膠二級(jí)結(jié)構(gòu)分子排布的失序，誘導(dǎo)明膠大納米聚集體的形成?？傊?，鹽離子的添加改變了明膠初始成核位點(diǎn)(接合區(qū))的形成和蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而阻止了剛性凝膠的形成[3]。

SOW等[11]在魚明膠溶液中加入蔗糖后，明膠的初始凝膠強(qiáng)度小于對(duì)照組，但儲(chǔ)存15 d后的凝膠強(qiáng)度大于對(duì)照，其原因可能是加入的蔗糖與明膠競(jìng)爭(zhēng)水分子發(fā)生水合反應(yīng)從而延緩凝膠時(shí)間。KOLI等[14]發(fā)現(xiàn)非電解質(zhì)，如糖、甘油的加入會(huì)穩(wěn)定氫鍵從而會(huì)增加凝膠強(qiáng)度，但將質(zhì)量濃度為7.5% 的蔗糖加入到黃花魚明膠中凝膠強(qiáng)度反而由170 g下降到150.5 g。而CHOI等[13]分別將質(zhì)量濃度為2%～14%的蔗糖處理豬明膠和魚明膠時(shí)，觀察到凝膠強(qiáng)度的增加。在SOW等[11]的研究中，當(dāng)將1.5%蔗糖加入到魚明膠中時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)凝膠強(qiáng)度的改善。這些現(xiàn)象可能與魚明膠來源和蔗糖濃度的差異有關(guān)。后續(xù)的研究中用多糖，如κ-角叉菜膠，進(jìn)行魚明膠的改性，κ-角叉菜膠中的帶負(fù)電的硫酸根基團(tuán)會(huì)與明膠中的帶正電的基團(tuán)發(fā)生靜電相互作用使明膠大分子的構(gòu)象變化，且這種相互作用的穩(wěn)定性高于明膠螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)中的氫鍵，從而提高明膠的凝膠強(qiáng)度和熱學(xué)穩(wěn)定性[15-16]。

針對(duì)糖與鹽對(duì)魚明膠的不同改性效果，科研工作者用不同濃度的鈣鹽和冷凝膠(gellan,一種胞外多糖)共同對(duì)羅非魚明膠進(jìn)行改性，冷凝膠能與魚明膠形成“異種連接區(qū)”以提高魚明膠的凝膠強(qiáng)度，而以合適濃度加入的Ca2+會(huì)與冷凝膠的陰離子域(COO-)直接交聯(lián)，顯著降低明膠聚集體的直徑，加固凝膠網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[17-18]。

2 輔助傳統(tǒng)提取法提取明膠

由于具有預(yù)期活性的明膠肽的制備通常是耗時(shí)的過程，而長(zhǎng)時(shí)間酸或堿或酶處理都會(huì)影響明膠的品質(zhì)，因此在短時(shí)間內(nèi)如能提供足夠的能量就可能提高明膠水解產(chǎn)物的生產(chǎn)效率及明膠品質(zhì)。出于這種考慮，科學(xué)家們采用了多種預(yù)處理方法來達(dá)到這種目的，主要包括超聲波和高壓輔助法。

2.1 超聲波輔助法提取明膠

YU等[19]基于建立的動(dòng)力學(xué)模型研究了超聲波預(yù)處理對(duì)膠原酶水解明膠動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。結(jié)果顯示，超聲波處理后，膠原酶催化的反應(yīng)速率常數(shù)和酶失活常數(shù)分別提高了27.5%和27.8%，水解活化能(活化能指啟動(dòng)水解反應(yīng)需要的最小能量[20])和酶滅活能分別降低了36.3%和43.0%。這些數(shù)據(jù)表明超聲波處理后的水解反應(yīng)更容易發(fā)生，進(jìn)而有助于提高明膠的產(chǎn)量。

為研究超聲波對(duì)鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)魚鱗明膠產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，TU等[21]在60 ℃熱萃取魚鱗明膠時(shí)用200 W的超聲波分別協(xié)助處理1、3和5 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲波處理時(shí)間越長(zhǎng)，明膠產(chǎn)量越高，超聲波處理組產(chǎn)量為30.94%～46.67%，比對(duì)照組提高了28.25%～61.56%。究其原因是在提取過程中超聲波的機(jī)械和空化效應(yīng)會(huì)使水分能更多地滲透到魚鱗基質(zhì)中，并提供了更多的攪動(dòng)來破壞魚鱗；增長(zhǎng)處理時(shí)間則直接提供了更多的能量來破壞穩(wěn)定膠原結(jié)構(gòu)的鍵以及α-鏈的肽鍵，加劇螺旋向線圈的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致更多的膠原轉(zhuǎn)化成可溶性明膠。

為探索超聲波影響明膠品質(zhì)的作用機(jī)理，YU等[19]采用了AFM、熒光光譜和FITR研究超聲處理對(duì)明膠結(jié)構(gòu)的影響。通過AFM檢測(cè)明膠發(fā)現(xiàn)，用聲波處理的明膠其膠粒的平均直徑、平均高度和體積都明顯下降，其原因可能是超聲波的物理效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子之間的靜電和疏水相互作用破壞，從而使蛋白質(zhì)顆粒的直徑變小；亦可能是超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣穴現(xiàn)象，使液體中的低壓氣泡突然形成并破裂，這種破裂會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)的剪切力，有助于超聲波的物理作用。熒光光譜發(fā)現(xiàn)超聲波處理會(huì)使明膠結(jié)構(gòu)中疏水殘基的微環(huán)境發(fā)生變化，從而影響明膠的溶解度。FITR觀察到因超聲波作用而發(fā)生顯著降低的酰胺I、II帶進(jìn)行去卷積和峰擬合，明膠α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的變化率分別為-28.04%、-2.74%、-32.29%和-15.38%。以上結(jié)果說明超聲波處理會(huì)改變明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這正是超聲波改變明膠品質(zhì)的原因。

2.2 高壓輔助法提取明膠

高壓技術(shù)是在一定的溫度下將食品等材料于100～1 000 MPa壓力下處理一段時(shí)間，達(dá)到殺菌、殺酶及改善食品功能性質(zhì)的一種加工技術(shù)[22]，其通過改變蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)從而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。ZHANG等[22]用100～500 MPa壓力處理巴沙魚皮樣品時(shí)，明膠提取率增長(zhǎng)幅度為 10.62%～ 15.62%；在提高產(chǎn)量的同時(shí)，高壓處理也提高了魚明膠的凝膠強(qiáng)度，當(dāng)壓力為300 MPa，處理時(shí)間為10 min得到的巴沙魚皮明膠凝膠強(qiáng)度最好，為282 g，顯著高于對(duì)照組的200 g，這歸功于高壓引起了蛋白質(zhì)聚集效應(yīng)。GMEZ-GUILLéN等[23]在熱水解提取鰨魚皮明膠時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)施壓時(shí)間(由10 min延長(zhǎng)到20 min)或加大壓力(由250 MPa升高至400 MPa)，所得明膠分子質(zhì)量分布情況將得到一定的改善，會(huì)得到較多高分子質(zhì)量聚合物肽，其α-、β-鏈，特別是γ-鏈含量將得到顯著提升，這表明一定程度的壓力和處理時(shí)間有誘導(dǎo)蛋白聚集作用。高分子質(zhì)量的肽含量越高，魚明膠的凝膠/融膠溫度越高，相應(yīng)地凝膠能力越強(qiáng)。高壓誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集作用在不同來源的明膠提取中亦有報(bào)道[24-26]。

高壓輔助法提取魚明膠，會(huì)使穩(wěn)定膠原蛋白的非共價(jià)鍵紊亂從而提高明膠的產(chǎn)量。適合的壓力及時(shí)間會(huì)對(duì)明膠的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集提高明膠中高分子質(zhì)量肽的含量，從而提高明膠的品質(zhì)。

3 酶對(duì)魚明膠改性研究

以上內(nèi)容討論的是對(duì)傳統(tǒng)酸堿提取明膠方法的優(yōu)化，與傳統(tǒng)的酸堿提取法相比，科研工作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解法具有處理時(shí)間短，廢物產(chǎn)生少等優(yōu)點(diǎn)，如在特定的酶與底物比例和溫度條件下使用胃蛋白酶對(duì)天然皮膚中膠原蛋白的消化作用可高達(dá)80%～90%(取決于來源)[27]。酶的合理利用已成為提取明膠的新方法。

用于魚明膠改性的酶可大致分為兩類：外源性蛋白酶和內(nèi)源性蛋白酶。有報(bào)道用外源酶酪氨酸蛋白酶對(duì)魚明膠的改性以提高魚明膠的功能性質(zhì)，但由于價(jià)格昂貴以致使用受限[28]。在不斷的探索后發(fā)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)是一種更好的選擇，這是一種從鏈球菌屬獲得的Ca2 +非依賴性酶，通過催化賴氨酸殘基的ε-氨基與谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基團(tuán)之間的交聯(lián)肽鍵的形成，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)N-ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯(lián)的形成[29]，故而成為提高魚明膠品質(zhì)的一種新酶。

除了通過外源酶降解明膠鏈外，存在于皮膚中的內(nèi)源性蛋白酶在高溫提取明膠時(shí)會(huì)使明膠長(zhǎng)鏈降解為短鏈。內(nèi)源蛋白酶主要包括內(nèi)臟中的消化性蛋白酶和魚皮膚中的膠原蛋白酶。膠原蛋白酶主要降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白結(jié)構(gòu)，特別是I型和II型膠原的三螺旋鏈的Gly775-Leu(Ile)776位點(diǎn)。膠原蛋白經(jīng)過膠原酶的初步特異性切割之后，會(huì)形成3/4-和1/4-的裂解產(chǎn)物并且使膠原蛋白自發(fā)變性(螺旋到線圈轉(zhuǎn)變)成為明膠[30]。膠原酶又被分為兩大類：金屬性膠原酶和絲氨酸膠原酶。魚皮中通常存在著絲氨酸膠原酶，這是一種熱激活性的蛋白酶[31]，能水解魚皮基質(zhì)，故而可能影響魚皮明膠的提取及所得明膠的性質(zhì)。以下分別闡述外源性蛋白酶及內(nèi)源性蛋白酶及其酶抑制對(duì)魚明膠改性的影響研究。

3.1 外源性蛋白酶對(duì)魚明膠改性的研究

WANGTUEAI等[29]在狗母魚(Sauridaspp.)魚鱗中提取明膠時(shí)探索了MTGase對(duì)魚鱗明膠的品性影響。將不同質(zhì)量濃度的MTGase(0.1%～0.6%)添加到明膠溶液中，發(fā)現(xiàn)隨著添加濃度的升高，所得魚明膠的凝膠強(qiáng)度隨之提高。該酶可有效地提高魚明膠的熱學(xué)穩(wěn)定性(膠融溫度)、機(jī)械強(qiáng)度(凝膠強(qiáng)度)及流變學(xué)特性，獲得的明膠產(chǎn)品可達(dá)到哺乳動(dòng)物來源明膠的物理特性，新工藝對(duì)魚鱗明膠的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了新的指導(dǎo)思路，具有巨大的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值；但MTGase催化法是通過MTGase酶使明膠中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，形成不可逆共價(jià)化合物，從而達(dá)到提高魚鱗明膠物理特性的目的。由于高濃度的MTGase使魚明膠中氨基酸發(fā)生了不可逆交聯(lián)，導(dǎo)致其在體內(nèi)的可吸收性下降，降低了魚明膠的營養(yǎng)價(jià)值及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。

針對(duì)以上問題，科研工作者研究發(fā)現(xiàn)低濃度的MTGase與其他物質(zhì)，如果膠，混合添加能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，能更有效地改善魚明膠低熔點(diǎn)低強(qiáng)度的缺陷的同時(shí)又對(duì)明膠的工業(yè)價(jià)值基本無影響。HUANG等[32]分別將不同質(zhì)量濃度的MTGase(0.02%、 0.04%、0.06%) 和果膠(1%、 3%、5%)加入到鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis) 魚鱗明膠溶液中研究?jī)煞N物質(zhì)對(duì)魚明膠品性的影響。發(fā)現(xiàn)用這2種添加物分別處理過后的魚明膠融膠溫度均有提高，且果膠改性效果更好，但MTGase對(duì)形成良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)更為有利。綜合二者特性， HUANG等[33]做了進(jìn)一步的研究，將二者混合添加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTGase和果膠的質(zhì)量濃度分別為0.06%和0.8%時(shí)，改性明膠具有最佳凝膠強(qiáng)度(523.89 g)、凝點(diǎn)/融點(diǎn)和粘性，且這種作用效果比MTGase或果膠單獨(dú)作用更為顯著。究其原因是適當(dāng)濃度的果膠會(huì)通過靜電相互作用和明膠形成果膠-明膠復(fù)合物，這種復(fù)合物會(huì)改變蛋白質(zhì)的聚集；MTGase則會(huì)催化果膠-明膠復(fù)合物之間的共價(jià)交聯(lián)以強(qiáng)化凝膠網(wǎng)絡(luò)，而這種共價(jià)鍵會(huì)影響三螺旋形成，有利于明膠的熱穩(wěn)定性；且明膠的質(zhì)地分析顯示高凝膠強(qiáng)度的明膠擁有更好的剛性、內(nèi)聚力和咀嚼性。以上結(jié)果表明，低濃度的MTGase與低濃度的果膠能協(xié)同改性魚明膠，在節(jié)約成本的同時(shí)能使其更好地應(yīng)用于市場(chǎng)，這為魚明膠的改性創(chuàng)立了新途徑。

3.2 內(nèi)源性蛋白酶和酶抑制劑

在魚皮膚中的內(nèi)源性蛋白酶也是可加以利用獲得所需的魚明膠品性。在提取魚明膠時(shí)，熱穩(wěn)定的內(nèi)源性蛋白酶可通過破壞膠原分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用導(dǎo)致膠原蛋白的不穩(wěn)定而分解為明膠；但提取溫度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)造成高分子質(zhì)量蛋白水解過度，使明膠的品性下降。因此，合理使用蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶的活性是獲得高品質(zhì)明膠的有效手段。

NALINANON等[34]使用內(nèi)源性蛋白酶輔助堿法提取大眼鯛(Priacanthustayenus)魚皮明膠，觀察到內(nèi)源性蛋白酶存在時(shí)提取效率提高，但明膠的β-，α1-和α2-鏈大量降解；當(dāng)加入抑制熱激活絲氨酸蛋白酶的大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)抑制蛋白酶的進(jìn)一步作用時(shí)，這種降解現(xiàn)象顯著減少，魚明膠品性顯著增強(qiáng)。同樣，AHMAD等[35]在提取魚明膠時(shí)添加0.04 mmol/L的SBT1后發(fā)現(xiàn)因SBT1抑制了內(nèi)源性的絲氨酸蛋白酶對(duì)膠原蛋白的自水解作用，明膠的產(chǎn)量雖有所下降，但保持了皮膚基質(zhì)中的高分子質(zhì)量肽的含量，使其無法實(shí)現(xiàn)三螺旋向無規(guī)線圈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，從而可以獲得高品性的魚明膠產(chǎn)品。雖然SBT1的加入會(huì)在一定程度上抑制膠原蛋白的水解而降低提取率，但SBT1的加入使利用內(nèi)源性酶改性的魚明膠具有更多高分子質(zhì)量肽、更多的三螺旋結(jié)構(gòu)及更為緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，更好的凝膠強(qiáng)度及更穩(wěn)定的乳化性能[36]。

4 結(jié)論與展望

魚明膠的品質(zhì)受多因素的影響，首先，魚類的生活環(huán)境不同，其魚基質(zhì)中氨基酸的分布、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)都會(huì)有所差異；其次，魚類在儲(chǔ)運(yùn)過程中的保存方式也會(huì)影響其品質(zhì)；魚明膠的提取存在著原材料膠原蛋白的水解變性及復(fù)性為明膠的過程，提取溫度高、時(shí)間長(zhǎng)、酸堿試劑濃度過高都會(huì)使魚膠原過分溶解，使其難以復(fù)性，導(dǎo)致魚明膠的品質(zhì)差；而提取溫度低、時(shí)間短、酸堿試劑濃度低則會(huì)降低魚明膠的產(chǎn)量。為克服該缺點(diǎn)，科研工作者在魚明膠的提取方法上進(jìn)行了革新，如用物理因素(高壓、超聲波)輔助酸堿法提取明膠；研究了外源性蛋白酶及內(nèi)源性蛋白酶對(duì)明膠改性的影響等。本文所闡述的方法在一定程度上提高了魚明膠的品質(zhì)，甚至達(dá)到哺乳動(dòng)物明膠的水平；但品質(zhì)與產(chǎn)量往往不能同時(shí)提升，說明魚明膠的提取方法還需要進(jìn)一步深入的研究及探討。未來的研究必須是如何在低成本、低污染的條件下實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)并獲得高品質(zhì)魚明膠。本實(shí)驗(yàn)室正嘗試一種新的方法，使用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)學(xué)結(jié)合法使魚明膠中的脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥基脯氨酸以提高其品質(zhì)的研究，以克服魚明膠的缺陷，使其達(dá)到哺乳動(dòng)物來源的明膠特點(diǎn)，使魚明膠的應(yīng)用走向食品醫(yī)藥工業(yè)等更寬廣的領(lǐng)域。