紅曲黃酒糟蛋白酶解物制備工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

林曉婕 何志剛 梁璋成 沈 萍 林曉姿 李維新

(福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所；福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003)

紅曲黃酒是福建特產(chǎn)，目前福建省共有黃酒生產(chǎn)企業(yè)119家，年生產(chǎn)能力12.50×107L，在生產(chǎn)過程中能產(chǎn)生20%～30%的酒糟[1]，即產(chǎn)生2.5萬t以上的紅曲黃酒糟。紅曲黃酒糟干基中含有20%～40%的蛋白質(zhì)，其中以水不溶性的谷蛋白為主。此外，酒糟中還含有大量的霉菌、細(xì)菌、酵母等微生物及其自身的代謝產(chǎn)物。大米經(jīng)過釀制，清蛋白所占比例略微提高，而球蛋白和谷蛋白所占比例降低，且不能完全溶解在堿溶液[2-3]。因此，相對(duì)于大米蛋白，黃酒糟中的蛋白溶解性較低，含有不溶性物質(zhì)多，難以直接利用。利用酶解技術(shù)可將黃酒糟制成易于吸收利用的水解蛋白，可極大地提高產(chǎn)品的附加值，具有很好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

黃酒按釀造黃酒所使用的曲種分為麥曲黃酒和紅曲黃酒。麥曲黃酒采用麥曲(添加量10%左右)、秈米或粳米為原料[4]，而紅曲黃酒采用紅曲(添加量2%～4%)、糯米為原料[5]。原料差異和釀制工藝的不同導(dǎo)致了麥曲黃酒糟和紅曲黃酒糟成分的不同。麥曲黃酒糟蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%左右。舒進(jìn)等[6]采用木瓜蛋白酶提取麥曲黃酒糟蛋白，未考慮酒糟中纖維素、淀粉等對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響。樓芳菲等[7]、左楠楠等[1]等采用堿性蛋白酶提取麥曲黃酒糟蛋白，未考慮酶解產(chǎn)品的風(fēng)味及其應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)所采用的紅曲黃酒糟蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40%，綜合考慮纖維素、淀粉等物質(zhì)的利用以及酶解產(chǎn)品的風(fēng)味。通過項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶、α-淀粉酶不僅可以酶解酒糟中的部分纖維素和淀粉轉(zhuǎn)化為多糖，還可以釋放出纖維和淀粉中包裹著的蛋白。因此，先進(jìn)行纖維素酶、淀粉酶酶解后，再進(jìn)行蛋白酶酶解，并通過酶解條件優(yōu)化，提高蛋白的提取率，綜合考慮紅曲黃酒糟蛋白酶解物風(fēng)味并對(duì)其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，該蛋白酶解物可開發(fā)為優(yōu)質(zhì)的功能營(yíng)養(yǎng)食品、調(diào)味品等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福建紅曲黃酒糟，60 ℃烘干粉碎后備用，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)38.2%，含水量10.3%，福建寧德黃家酒業(yè)。

纖維素酶(40 000 U/g)，α-淀粉酶(40 000 U/g)，堿性蛋白酶(200 000 U/g)、中性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(200 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(15 000 U/g)、胃蛋白酶(10 000 U/g)，江蘇銳陽生物科技有限公司。其他試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；UV-1750紫外可見分光光度計(jì)；ZDJ-400H滴定儀；Foss 2000自動(dòng)凱氏定氮儀。

1.3 方法

1.3.1 紅曲黃酒糟的前處理

以紅曲黃酒糟和水固液比1∶10混合，先以纖維素酶酶解，反應(yīng)pH 5，溫度65 ℃，時(shí)間0.5 h，再以α-淀粉酶酶解反應(yīng)pH 6.0，溫度70 ℃，時(shí)間2 h。

1.3.2 蛋白酶的篩選實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 單酶酶解

取經(jīng)前處理后的紅曲黃酒糟，分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶進(jìn)行酶解，pH、溫度均按說明書推薦參數(shù)操作，酶解時(shí)間2 h，加酶量2 000 U/g，10 000 g離心15 min后收集上清液，測(cè)定蛋白含量。

表1 不同蛋白酶對(duì)蛋白提取率的影響

1.3.2.2 復(fù)合酶解

復(fù)合方式為：堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶，比例均為1∶1，加酶量2 000 U/g，10 000 g離心15 min后收集上清液，測(cè)定蛋白含量。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

1.3.3.1 復(fù)合蛋白酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)前處理的紅曲黃酒糟，以復(fù)合酶比例(中性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶)、固液比、pH、溫度、時(shí)間和加酶量作為單因素，研究單因素對(duì)蛋白提取率的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

以蛋白提取率為指標(biāo)，在四因素三水平上對(duì)pH、溫度、時(shí)間、加酶量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.3.4 紅曲黃酒糟蛋白酶解物的感官評(píng)價(jià)

參照王雨生等[8]，采用綜合評(píng)分法對(duì)紅曲黃酒糟蛋白酶解物進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)由12位具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)人員，采用評(píng)分法對(duì)紅曲黃酒糟蛋白酶解物的整體滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)。設(shè)定5個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)及權(quán)重系數(shù)，整體滋味通過加權(quán)法將各個(gè)指標(biāo)的平均分加權(quán)相加，得出評(píng)分。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風(fēng)味、甜味、協(xié)調(diào)性評(píng)分均為0～5分，0分表示完全無鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風(fēng)味、甜味以及協(xié)調(diào)性差；分值越大，表示各指標(biāo)越優(yōu)，整體滋味越好。指標(biāo)權(quán)重均為20%。

1.3.5 紅曲黃酒糟蛋白酶解物的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

化學(xué)評(píng)分(chemical score，CS)：參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United，F(xiàn)AO)的方法[9]。

氨基酸評(píng)分(amino acid score，AAS)：樣品中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占FAO和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)模式中相應(yīng)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比例[9]。

必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index，EAAI)：樣品蛋白質(zhì)中各種必需氨基酸含量與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的各種氨基酸含量之比的加權(quán)平均值[10]。

生物價(jià)(biological valence，BV)：BV=1.09×EAAI-11.7。

營(yíng)養(yǎng)指數(shù)(nutritional index，NI)：EAAI與蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乘積[11]。

氨基酸比值系數(shù)分(score of ratio coefficient ofamino acid，SRCAA)：參照陳麗麗等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 檢測(cè)方法

1.3.6.1 蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。

1.3.6.2 肽含量：參照朱俊穎[12]等方法測(cè)定。

適量取2種粉碎樣品,將少許微膠囊粉末撒于貼了雙面膠的樣品臺(tái)上,吹去多余粉末,噴金30 s后用高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品形態(tài)并拍照。

1.3.6.3 氨基酸分析：采用GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的測(cè)定中所列方法測(cè)定氨基酸含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用DPS3.01、Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲黃酒糟的預(yù)處理

以纖維素酶和淀粉酶預(yù)處理紅曲黃酒糟，可使原料結(jié)構(gòu)松散，釋放被束縛的大多數(shù)水溶性蛋白，并使得淀粉酶和蛋白酶能夠進(jìn)入內(nèi)部促進(jìn)蛋白的降解和溶解[13-14]。大米蛋白存在于淀粉顆粒的外表面或填充在淀粉顆粒中，通過二硫鍵形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與淀粉緊密結(jié)合[15-16]。α-淀粉酶可水解淀粉，部分糖類物質(zhì)與不溶性蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)并未水解，但其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在淀粉酶解的過程中顯示出蛋白凝膠體的骨架，使得蛋白的作用位點(diǎn)暴露更有利于蛋白酶的作用。蛋白酶酶解將蛋白水解成短肽，打開蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鏈展開，使得更多的親水集團(tuán)暴露，從而促進(jìn)了蛋白溶出[17-18]。經(jīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，可提高蛋白提取率9.72%。

注：C：蛋白酶；A+C：纖維素酶+蛋白酶；B+C：淀粉酶+蛋白酶；A+B+C：纖維素酶+淀粉酶+蛋白酶圖1 不同預(yù)處理對(duì)蛋白提取率的影響

2.2 蛋白酶的篩選結(jié)果

2.2.1 單酶酶解

由圖2可見，各蛋白酶對(duì)酒糟蛋白水解能力之間存在較大差異，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的的蛋白提取率較高，分別達(dá)50.63%、47.04%和44.71%，與其他各處理間的差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。谷蛋白占大米蛋白的70%～90%，分子內(nèi)和分子間廣泛存在的二硫鍵以及分子內(nèi)存在的巰基，交聯(lián)凝聚形成谷蛋白，因此，造成谷蛋白較低的水溶性[19-21]。通過蛋白酶的降解和修飾，對(duì)蛋白分子在不同位點(diǎn)進(jìn)行切割，二硫鍵打開，蛋白降解為可溶性多肽和部分氨基酸，溶解性得到改善。由于堿性蛋白酶具有廣泛的消化位點(diǎn)，因此具有較好的酶解效果[22]。堿性蛋白酶酶解液具有較好的鮮味，但香味等其他感官指標(biāo)評(píng)分不佳，導(dǎo)致整體滋味一般。中性蛋白酶酶解液和風(fēng)味蛋白酶酶解液，兼具較好的提取率和感官評(píng)分。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶分別和中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶復(fù)合，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合，以期獲得更優(yōu)的蛋白提取率和改善酶解液風(fēng)味。

注：橫坐標(biāo)1～5分別為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶圖2 蛋白酶對(duì)蛋白提取率和感官評(píng)分的影響

2.2.2 復(fù)合酶酶解

復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3表明，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶解提取率達(dá)47.97%，高于中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶單酶提取率，達(dá)極顯著(P<0.01)水平。同時(shí)，酶解液具有較好的鮮味、香味、紅曲黃酒糟特征風(fēng)味，整體協(xié)調(diào)性較好，與兩種單酶酶解風(fēng)味比較，具有更好的整體滋味。中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雖然能一定程度改善堿性蛋白酶酶解液風(fēng)味，但效果不顯著。同時(shí)，由于兩種酶均不處于最適酶解條件，或者只有一種酶處于最適酶解條件，導(dǎo)致蛋白提取率較低。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解并進(jìn)行優(yōu)化。

注：橫坐標(biāo)1～3分別為堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶+中性蛋白酶圖3 復(fù)合蛋白酶對(duì)蛋白提取率和感官評(píng)分的影響

2.3 蛋白酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

黃酒糟經(jīng)纖維素酶、淀粉酶處理后，在不同的復(fù)合酶比例(中性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶)、固液比、pH、溫度、時(shí)間和加酶量條件下使用復(fù)合酶酶解，研究不同酶解條件對(duì)蛋白提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 各因素對(duì)蛋白提取率的影響

圖4表明，復(fù)合酶比例(中性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶)對(duì)蛋白提取率的影響呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)中性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶為2∶1時(shí)，蛋白提取率達(dá)54.64%。隨著固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)固液比為1∶10和1∶12時(shí)，有利于酶與底物反應(yīng)充分，蛋白提取率分別達(dá)54.64%和55.72%，差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)，綜合經(jīng)濟(jì)成本考慮，適宜的固液比為1∶10。隨著pH的上升，蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，pH值7.0的處理蛋白提取率最高。溫度為50 ℃的處理蛋白提取率最高，達(dá)54.64%，各處理間差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。當(dāng)溫度超過50 ℃，蛋白酶活性逐漸失活，酶解度降低。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。酶解時(shí)間2 h與3 h的蛋白提取率無顯著差異。隨著固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。隨著加酶量的增加，蛋白提取率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)加酶量為2 500 U/g時(shí)，蛋白提取率為59.41%，與加酶量3 000 U/g處理的61.04%差異不顯著(P>0.05)。從經(jīng)濟(jì)成本考慮，適宜的蛋白酶加酶量為2 500 U/g。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 Box Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box Behnken設(shè)計(jì)原理，在pH、溫度和時(shí)間、加酶量上進(jìn)行29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4.2 二次回歸模型與方差分析

利用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立蛋白提取率對(duì)pH、溫度、時(shí)間、加酶量4個(gè)自變量的二次多項(xiàng)式回歸模型，回歸系數(shù)R2=0.984 7。

Y=+59.42-3.12X1+0.88X2+2.87X3+1.99X4-1.65X1X2-1.85X1X3-0.40X1X4+0.45X2X3+0.93X2X4+0.20X3X4-3.48X12-4.12X22-2.31X32-2.24X42

方差分析結(jié)果見表4。該模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著，回歸效果好，可信度高。4個(gè)因素對(duì)綜合值影響主次順序：X1(pH)>X3(時(shí)間)>X4(加酶量)>X2(溫度)，均達(dá)到極顯著水平。交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)蛋白提取率的影響極顯著，交互項(xiàng)X2X4對(duì)蛋白提取率的影響顯著。

2.4.3 交互作用因子分析

交互項(xiàng)中pH和溫度、pH和時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響極顯著(P<0.01)，溫度和加酶量對(duì)蛋白提取率的影響顯著(P<0.05)。等高線圖的橢圓形排列較密集，說明因素變化對(duì)響應(yīng)值影響較大，若調(diào)整pH、溫度、加酶量至最適水平，應(yīng)可顯著提高蛋白提取率。

表4 回歸模型方程方差分析

注：**表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)。

2.4.4 最佳工藝預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

黃酒糟蛋白與大米胚乳蛋白相似。大米胚乳蛋白由60%～65%的PB—Ⅱ型蛋白、20%～25%PB—I型蛋白以及10%～15%清蛋白組成[15]。采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解PB—Ⅱ型蛋白和清蛋白，具有較好的酶解效果。通過利用Design Expert 8.0.5軟件模型進(jìn)行優(yōu)化，計(jì)算得出最佳的工藝參數(shù)為：pH 6.15，溫度52.0 ℃，時(shí)間3 h，加酶量2 825 U/g在此條件下，蛋白提取率為63.06%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在模型優(yōu)化的工藝參數(shù)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3次重復(fù)，蛋白提取率分別為63.75%、63.64%、63.47%，平均值63.62%，模型擬合度較好。

2.5 黃酒糟蛋白酶解物的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及風(fēng)味氨基酸

黃酒糟蛋白酶解物中非需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為天門冬氨酸10.90%、谷氨酸14.30%、絲氨酸5.42%、組氨酸2.36%、精氨酸4.97%、甘氨酸6.04%、脯氨酸5.37%、丙氨酸5.32%。黃酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及營(yíng)養(yǎng)評(píng)分表如表5。黃酒糟蛋白酶解物18種氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.91%，第一限制性氨基酸為色氨酸，占總氨基酸的0.75%。黃酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸占總氨基酸的41.30%。在必需氨基酸中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為亮氨酸8.36%。表5表明，除蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸以外，各必需氨基酸CS較大，與標(biāo)準(zhǔn)雞蛋蛋白的對(duì)應(yīng)必需氨基酸組成接近。由于谷物中賴氨酸含量低，且在加工過程中易被破壞，故賴氨酸為大部分谷物的第一限制性氨基酸，同時(shí)賴氨酸也是人體的第一必需氨基酸。黃酒糟蛋白酶解物中賴氨酸AAS較高，這可能是因?yàn)椋诩t曲黃酒發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生。賴氨酸具有協(xié)助人體吸收利用其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能、提高中樞神經(jīng)組織等重要功能[10]。因此，黃酒糟蛋白酶解物營(yíng)養(yǎng)均衡優(yōu)于谷物。黃酒糟蛋白酶解物的EAAI、BV、NI分別為76.52、71.70、74.99，說明黃酒糟蛋白酶解物可被機(jī)體吸收利用程度較高。SRCAA為79.03，表明黃酒糟蛋白酶解物中各種必需氨基酸偏離模式氨基酸的離散度較小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較高，可以確定黃酒糟蛋白酶解物為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。

黃酒糟蛋白酶解物中鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸)和甘氨酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)53.50%，具有良好的鮮味和甘味，可用于開發(fā)高檔風(fēng)味調(diào)味品以及作為功能食品添加劑等。肽含量達(dá)22.4 g/L，優(yōu)于分段水解，后續(xù)可進(jìn)行多肽調(diào)味液的研發(fā)。

表5 氨基酸組成與評(píng)分

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，最佳酶解工藝為：以紅曲黃酒糟和水固液比1∶10，以纖維素酶和淀粉酶酶解預(yù)處理黃酒糟，選用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶以2∶1比例復(fù)合后，在pH 6.15，溫度52.0 ℃，時(shí)間3 h，加酶量2 825 U/g條件下酶解，蛋白提取率達(dá)63.62%。黃酒糟蛋白酶解物中鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸)和甘氨酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)53.50%，具有良好的鮮味和甘味。黃酒糟蛋白酶解物必需氨基酸指數(shù)、生物價(jià)、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)和氨基酸比值系數(shù)分分別為76.52、71.70、74.99、79.03，營(yíng)養(yǎng)均衡、合理，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，可用于開發(fā)高檔調(diào)味品以及作為功能食品添加劑等。