超聲輔助處理對乳清分離蛋白糖基化產(chǎn)物的理化特性影響

王 麒 李宛蓉 秦新光 劉 剛

(武漢輕工大學食品科學與工程學院，武漢 430023)

美拉德反應是糖分子與蛋白質(zhì)分子上的氨基通過共價鍵結(jié)合形成糖基化蛋白的化學反應[6]，而糖基化改性后的蛋白熱穩(wěn)定性、乳化性等物化性質(zhì)均明顯提高。目前，美拉德反應主要通過濕法和干法兩種方式進行，而且兩種方法所得的美拉德反應產(chǎn)物性質(zhì)均優(yōu)于原蛋白。研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-葡聚糖糖基化產(chǎn)物的乳化性明顯增強[7]。杜研學等[8]利用干法美拉德反應，對從米渣中提取的谷蛋白進行糖基化改性，其所得的糖基化改性產(chǎn)物表面疏水性顯著降低，功能性質(zhì)在廣泛pH值范圍內(nèi)顯著提高。

超聲技術(shù)在食品工業(yè)的應用十分廣泛[9-10]，由于超聲輔助生產(chǎn)具有提高生產(chǎn)率、縮短加工時間、操作簡單、節(jié)約成本等優(yōu)點，近年來受到從業(yè)者的青睞[11]。超聲輔助技術(shù)也在美拉德反應中得到應用，Li等[12]研究了超聲處理對花生分離蛋白-葡甘露聚糖共聚物的物化性質(zhì)影響，其結(jié)果表明超聲處理花生分離蛋白與葡甘露聚糖，促進了糖基化反應的進行，其糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)明顯提高。

本試驗采用超聲輔助與水浴加熱兩種方式促進乳清蛋白糖基化反應，制備乳清分離蛋白與葡萄糖共聚物，并比較兩種處理方式制備的糖基化產(chǎn)物在游離氨基以及理化性質(zhì)等方面的差異，以此探討超聲輔助羰基化反應的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級大豆油；乳清分離蛋白(蛋白質(zhì)量分數(shù)96.88%)；葡萄糖(分析純)；其他試劑均為分析純：國藥集團化學分析有限公司。

1.2 儀器

T-18型高速分散儀；超聲儀(探頭為Φ 6mm) FS-系列超聲波處理器；Malvern200型激光粒度分析儀；高壓循環(huán)均質(zhì)機；TU-1800紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取等量的乳清分離蛋白(WPI)和葡萄糖(glucose ,G)溶于0.2 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 乳清分離蛋白、葡萄糖混合溶液，攪拌1 h并預熱至一定溫度。分別取幾份混合溶液在最佳超聲條件下(超聲溫度70 ℃，超聲功率300 W，預實驗測得)進行不同超聲時間(5、10、15、20、30、40、60 min)處理。將所得溶液進行冷凍干燥，凍干后的粉末4 ℃下保存。另取等量的混合溶液在水浴鍋中進行70 ℃處理，加熱時間分別為3、6、9、12、24、28、32 h。后續(xù)處理步驟與超聲處理組相同。

對于政府而言，水權(quán)初始分配除了需要考慮諸多因素以確保分配結(jié)構(gòu)合理外，還需要確保分配規(guī)則滿足時代發(fā)展需要。從歷史發(fā)展來看，水權(quán)合理分配規(guī)則呈現(xiàn)動態(tài)發(fā)展之勢，它是時間和空間的產(chǎn)物，會隨時空的變化而變遷。影響水權(quán)合理分配規(guī)則變化的因素主要有兩個：一是自然環(huán)境的變化；二是社會環(huán)境變化。

1.3.2 游離氨基測定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法[13]測定游離氨基含量從而計算WPI接枝度。取40 mg OPA溶于1 mL甲醇中，加入0.1 mol/L 25 mL硼砂溶液、體積分數(shù)為20% 2.5 mL十二烷基磺酸鈉溶液、100 μL β-巰基乙醇，并用去離子水定容至50 mL，即得OPA試劑。準確稱取超聲、水浴處理時間分別為0、20、40、60 min的蛋白樣品，將其配制成0.5 mg/mL的溶液，取樣品溶液400 μL，加入8 mLOPA試劑，混合均勻后置于35 ℃水浴2 min，取反應后的溶液在340 nm下測定吸光值。并以賴氨酸作標準曲線，計算樣品中游離氨基的含量，并計算接枝度，接枝度(DG)的計算公式：

DG =(A0-At) /A0×100%

式中：A0為未進行糖基化反應WPI的游離氨基含量；At為糖基化反應后WPI-G接枝物的游離氨基含量。

1.3.3 溶解性測定

分別準確稱取一定量的WPI、超聲處理40 min、水浴28 h處理的樣品，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，將溶液等體積分為6份，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將6份溶液的pH值依次調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8，室溫下磁力攪拌10 min (攪拌過程中保持pH值穩(wěn)定) 后，在4 ℃下離心15 min (10 000 r/min)，取上清液用酶標儀測定溶液在590 nm處的吸光度，以5 mg/mL BSA溶液作標準曲線，計算樣品中蛋白濃度。蛋白質(zhì)的溶解性表示為上清液蛋白濃度占相應的總蛋白濃度的百分比 (A590/A總×100%)。

1.3.4 乳化性測定

參考Meng等[14]的方法，并略有改動，分別取超聲處理40 min、水浴28 h處理后的WPI-G共聚物樣品，用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%的溶液，取3 mL的蛋白溶液和1 mL大豆油采用高速均質(zhì)機在20 000 r/min室溫下均質(zhì)1 min，從試管底部取50 μL勻漿液，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液稀釋100倍并用渦旋儀混合均勻，以SDS溶液為空白，用紫外分光光度計分別測定500 nm處的吸光值。放置10 min后同樣位置測定吸光值。乳化性系數(shù)EAI和乳化穩(wěn)定性系數(shù)ESI由公式計算：

EAI=(2.303×2×n×A0)/(C×Φ×10 000)

ESI=A0×Δt/(A0-A10)

式中：n為稀釋倍數(shù)；Φ為油相體積分數(shù)0.25；C為蛋白質(zhì)的濃度/g/mL；A0為均質(zhì)后樣品500 nm吸光度；A10為均質(zhì)10 min后的樣品在500 nm處的吸光度；Δt為10 min

1.3.5 乳液制備及粒徑分析

分別稱取WPI以及超聲處理40 min、水浴28 h處理后的WPI-G共聚物分別溶于pH為7.5的磷酸鹽緩沖體系中，配制成2%(m/V)的溶液，攪拌使其完全溶解，加入0.02%的疊氮鈉，抑制微生物的生長，以樣品溶液為水相。以油水比為1∶9的比例加入大豆油，置于高速均質(zhì)機中以20 000 r/min轉(zhuǎn)速進行高速分散，制備粗乳，再將粗乳液通過高壓均質(zhì)機均質(zhì)(均質(zhì)溫度4 ℃，均質(zhì)壓力30 MPa)得到乳液，并將乳液置于4 ℃冰箱保存。各取三種乳液10 μL，用蒸餾水稀釋100倍，置于Malvern 200型激光粒度分析儀中分析粒徑大小，20 d后，另取乳液10 μL，蒸餾水稀釋100倍，再次測量乳液粒徑大小變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基含量分析

測定兩種處理方式下蛋白溶液中的游離氨基含量，見表1，水浴加熱處理WPI的游離氨基含量無明顯變化，當WPI以超聲波法進行加熱時，游離氨基的質(zhì)量濃度從0.066 mg/mL增至0.076 mg/mL。表明超聲處理有助于WPI與葡萄糖聚合反應時釋放出更多的游離氨基。這與Mu等[15]的結(jié)論相吻合，超聲處理過程中產(chǎn)生的泡沫空化效應增加了坍塌氣泡周圍區(qū)域的局部溫度和壓力，導致蛋白質(zhì)伸展、水解，肽鍵被破壞，大量的氨基酸殘基暴露出來。

表1 不同處理方式下WPI游離氨基含量

注：其他標準偏差均<0.001。

2.2 接枝度分析

接枝度可由游離氨基含量計算，因此兩種處理方式下WPI和葡萄糖的接枝度結(jié)果如表2所示，同一接枝度下的超聲輔助處理下的糖基化反應時間明顯低于水浴加熱時間，超聲輔助法處理WPI與葡萄糖接枝度達到44.61%只需30 min，而相比之下，通過傳統(tǒng)加熱法接枝度達到45.05%則需24 h。此外，無論是水浴加熱還是超聲波處理，共聚物的接枝度均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。這與JIANG等[16]的研究相符，可能是由于在美拉德反應初始階段，乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，乳清分離蛋白與葡萄糖受熱后逐步結(jié)合，接枝度逐漸提高；但過度加熱時，一方面使乳清分離蛋白中的部分賴氨酸被破壞，另一方面則造成乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)的充分伸展，乳清分離蛋白分子之間的相互作用增強，導致蛋白凝聚、沉淀，不利于接枝反應的進行，最終導致接枝度反而降低。因此本文選取超聲處理40 min、水浴處理28 h作為后續(xù)試驗的樣品處理條件，此時兩種處理條件得到的共聚物接枝度均為48%左右，表明美拉德反應程度較為接近，作為后續(xù)實驗的樣品處理條件具有可比較性，以便進一步比較超聲與水浴兩種處理方式對反應產(chǎn)物物化性質(zhì)的影響更為明顯。

表2 水浴和超聲處理下WPI和葡萄糖的接枝度

2.3 溶解性分析

蛋白的溶解性與其他物化性質(zhì)具有相關(guān)性，因此我們對不同pH值下的WPI及兩種處理方式的WPI-G共聚物進行溶解性分析，結(jié)果如圖1所示，未經(jīng)處理的WPI在pH在5.0左右溶解度最低，這是由于WPI的pH在等電點(5.0)左右，此時蛋白凈電荷為零，由于電荷不對稱而產(chǎn)生靜電相互作用引起蛋白發(fā)生聚集。而改性后的WPI糖基化產(chǎn)物在pH 5.0處溶解度明顯提高，且超聲處理相比于水浴熱處理條件下的WPI-G共聚物溶解度更好?？赡苁怯捎诔曁幚韺е码逆I斷裂，蛋白親水性氨基暴露提高了蛋白質(zhì)的溶解性。

圖1 不同處理方式下WPI-G共聚物的溶解度

2.4 乳化性分析

WPI和WPI-G共聚物的乳化性和乳化穩(wěn)定性變化如圖2所示，隨著超聲處理時間的延長，WPI-G共聚物的乳化性逐漸增強，EAI值在超聲時間為40 min時達到峰值。而水浴加熱WPI-G糖基化產(chǎn)物的EAI值也明顯高于原WPI。超聲處理40 min的WPI-G糖基化產(chǎn)物EAI值由初始值20.67 m2/g增加至40.84 m2/g，增加了99%。與水浴處理的WPI糖基化產(chǎn)物相比EAI值增加了59%。這均表明，超聲輔助糖基化反應有效地改善了乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。而且，超聲輔助糖基化反應產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性指數(shù)隨超聲時間的延長而逐漸增加，在超聲時間為30 min時達到峰值76.85 min，而后逐漸降低，可能是由于超聲時間過長，溶液溫度升高，蛋白分子結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)絮凝等現(xiàn)象，導致后期乳化穩(wěn)定性降低。

注：0表示W(wǎng)PI-G共聚物水浴加熱28 h。圖2 WPI及WPI-G共聚物不同超聲處理時間下的EAI和ESI值

2.5 粒徑分布

兩種處理方式下制得的WPI共聚物乳液粒徑分布如圖3所示，結(jié)果表明兩種糖基化產(chǎn)物為基質(zhì)的乳液平均粒徑均明顯小于原WPI乳液，且超聲處理所得的糖基化產(chǎn)物乳液粒徑更小，平均粒徑為60 nm左右，水浴處理的WPI-G共聚物乳液平均粒徑為200 nm左右，原WPI乳液平均粒徑為300 nm左右。而且三種乳液于4 ℃冰箱中靜置20 d后，所測得的乳液平均粒徑均沒有明顯變化，超聲處理制得的WPI-G共聚物乳液平均粒徑仍小于100 nm。表明WPI及WPI-G共聚物乳液均具有良好的儲藏穩(wěn)定性。這可能是由于WPI及其共聚物作為乳化劑提高了乳液穩(wěn)定性[17]，且超聲處理的WPI-G共聚物乳化性高于水浴處理的WPI-G共聚物，可能是由于超聲處理能量更加集中，使WPI與葡萄糖的接枝反應進行的更加完全，從而使其處理后的共聚物乳化性能更好。

圖3 不同處理方式下WPI和WPI-G共聚物乳液的的粒徑分布

3 結(jié)論

3.1 乳清分離蛋白和葡萄糖的最佳超聲處理溫度為70 ℃，功率為300 W，當超聲時間為40 min時，蛋白溶液中游離氨基濃度增加，且此時接枝度最佳為48.10%，美拉德反應程度達到最佳，而水浴加熱處理達到相同的接枝度需耗時28 h。

3.2 超聲輔助處理和水浴加熱處理的WPI-G共聚物在等電點附近的溶解性均明顯增強，溶解度由19.09%增大至47.95% 。在等pH條件下超聲處理的WPI-G共聚物的溶解性優(yōu)于水浴加熱處理。

3.3 超聲輔助處理WPI- G共聚物的乳化性增強，其乳化性數(shù)由20.67 m2/g增至40.84 m2/g，增大了99%，而相對于水浴加熱法乳化系數(shù)25.3 m2/g增大了59%。

3.4 超聲輔助處理所得的WPI-G共聚物乳液平均粒徑為60 nm，明顯小于水浴加熱處理的WPI-G乳液粒徑(200 nm)，二者與未處理的WPI乳液(粒徑300 nm)相比，粒徑更小、更穩(wěn)定，儲藏穩(wěn)定性更好。