息肉狀脈絡(luò)膜血管病變患者房水中IL-8及其受體的表達(dá)

李 臻，王少杰，劉國(guó)立，簡(jiǎn) 瑞

0引言

息肉狀脈絡(luò)膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)屬于臨床常見視網(wǎng)膜病變，調(diào)查顯示在亞洲PCV發(fā)病率為60%～90%，患者多出現(xiàn)滲出型視網(wǎng)膜脫離及視網(wǎng)膜出血，嚴(yán)重者導(dǎo)致視力損害[1]。PCV發(fā)病原因及危險(xiǎn)因素目前尚不明確，多數(shù)研究認(rèn)為PCV是環(huán)境、遺傳、生物因素相互作用的結(jié)果[2]。近期研究證實(shí)，病理性血管形成是導(dǎo)致PCV發(fā)生的直接原因，在受到外界刺激后內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致新生血管形成[3]。研究證實(shí)白介素-8(interleukin-8，IL-8)為血管生成因子，且其受體CXCR1、CXCR2也參與血管形成，三者在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[4]。然而IL-8是否參與PCV的發(fā)生，目前尚不明確。因此本研究通過檢測(cè)PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平，以明確其在PCV發(fā)生中的作用。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選擇2016-04/2018-03在本院進(jìn)行治療的PCV患者67例作為研究對(duì)象，其中男45例，女22例；左眼32眼，右眼35眼；年齡45～84(平均60.84±6.14)歲；病程1～24(平均10.36±2.48)mo；單息肉37例，多息肉30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)視網(wǎng)膜出現(xiàn)紅色、橘黃色結(jié)節(jié)病灶；(2)吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)檢測(cè)黃斑區(qū)發(fā)現(xiàn)典型息肉病灶，且伴脈絡(luò)膜血管網(wǎng)；(3)光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)檢測(cè)顯示漿液性出血性視網(wǎng)膜色素上皮層脫離。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變者；(2)病理性近視、年齡相關(guān)性黃斑變性等脈絡(luò)膜新生血管疾病者；(3)近期內(nèi)接受抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、光動(dòng)力療法及手術(shù)治療者；(4)心、肝、腎臟等嚴(yán)重受損者。另選取同期在本院進(jìn)行治療的50例白內(nèi)障患者作為對(duì)照組，其中男32例，女18例；年齡39～80(平均60.57±6.14)歲；排除合并青光眼、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病者。兩組研究對(duì)象的年齡、性別構(gòu)成比等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集PCV組患者在進(jìn)行玻璃體腔注射前抽取房水150μL；對(duì)照組患者在進(jìn)行白內(nèi)障手術(shù)治療前抽取房水150μL，所有樣品均保存在-80℃冰箱中備用。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表達(dá)參照RNA提取試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)說明書提取房水總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Primer3軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，見表1。反應(yīng)體系(20μL)：2×SYBR Mix 10μL，10倍稀釋cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，H2O 8μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。在Rotor-Gene3000 real-time PCR儀(德國(guó)QIAGEN公司，型號(hào)：Rotor-Gene Q)上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃ 預(yù)變性10s，95℃ 10s，62℃ 20s，72℃ 2min，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后保存數(shù)據(jù)，利用儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3最佳矯正視力和中心凹視網(wǎng)膜厚度檢測(cè)所有患者入院后均采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)視力表測(cè)量最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)，并換算為L(zhǎng)ogMAR視力。

表1引物序列

基因引物序列(5-3)IL-8ForwardATGACTTCCAAGCTGGCCGTGReverseCTCTTCAAAAACTTCTCCCXCR1ForwardGAGGTTGTGTGTGGAAGGTGReverseAGGTTGATGTTTTGGCAGTGCXCR2ForwardTGGGCAACAATACAGCAAACTReverseGCACTTAGGCAGGAGGTCTTAβ-actinForwardTCCTCCCTGGAGAAGAGCTAReverseTCAGGAGGAGCAATGATCTTG

組別IL-8CXCR1CXCR2PCV組1.25±0.061.46±0.041.33±0.09對(duì)照組0.57±0.130.42±0.110.48±0.12t37.79871.40543.798P<0.001<0.001<0.001

注：對(duì)照組：白內(nèi)障患者。

采用OCT掃描儀檢測(cè)中心凹視網(wǎng)膜厚度(central macular thickness，CMT)，掃描時(shí)以中心凹視網(wǎng)膜為主，采用6mm×6mm 3D模式，縱向、橫向分辨率分別為3.87、11.4μm，掃描深度設(shè)定為2mm，記錄CMT，每位患者重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

2結(jié)果

2.1兩組患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2mRNA水平比較與對(duì)照組相比，PCV組患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

2.2兩組患者BCVA和CMT的比較對(duì)照組患者BCVA(0.09±0.02)顯著優(yōu)于PCV組(0.19±0.02)，CMT(266.86±20.42μm)顯著低于PCV組(386.15±21.79μm)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.755、30.085，均P<0.001)。

2.3PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平與BCVA、CMT的相關(guān)性分析PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平與BCVA(LogMAR)呈正相關(guān)(r=0.438，P<0.01；r=0.346，P=0.013；r=0.385，P=0.002)，與CMT呈正相關(guān)(r=0.378，P=0.005；r=0.606，P<0.01；r=0.357，P=0.011)，見圖1。

2.4影響PCV發(fā)生的多因素分析以PCV發(fā)生作為因變量，將年齡、性別、IL-8等指標(biāo)作為自變量進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2、BCVA、CMT是影響PCV發(fā)生的危險(xiǎn)因素，見表3。

圖1PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2與BCVA、CMT相關(guān)性分析。

圖2IL-8、CXCR1、CXCR2診斷PCV的ROC曲線。

表3影響PCV發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

變量βSEWald χ2POR95%CI年齡0.1280.2490.2640.1891.1371.106～1.169性別0.1690.1152.1600.0741.1841.059～1.323CMT0.5660.4271.7570.0191.7621.349～2.302BCVA0.6130.4391.949<0.0011.8461.156～2.947IL-80.7830.5262.216<0.0012.0531.687～2.498CXCR10.8510.4094.329<0.0012.3411.368～4.006CXCR20.7970.4321.844<0.0012.2191.336～3.685

2.5IL-8、CXCR1、CXCR2對(duì)PCV的診斷價(jià)值ROC曲線分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2對(duì)PCV具有一定診斷價(jià)值。IL-8診斷PCV的曲線下面積(AUC)為0.882(P<0.01)，敏感性為80.60%，特異性為88.06%；CXCR1診斷PCV的AUC為0.860(P<0.01)，敏感性為76.11%，特異性為83.58%；CXCR2診斷PCV的AUC為0.812(P<0.01)，敏感性為71.64%，特異性為85.07%，見圖2、表4。

3討論

PCV屬于一種特殊眼底疾病，病情嚴(yán)重則會(huì)影響患者視力，甚至導(dǎo)致失明，近年來我國(guó)發(fā)病率逐年升高[5]。PCV發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，具體機(jī)制尚不明確。研究認(rèn)為，

表4IL-8、CXCR1、CXCR2對(duì)PCV的診斷價(jià)值

檢測(cè)指標(biāo)AUC標(biāo)準(zhǔn)誤95%CIZPIL-80.8820.0330.847～0.91612.203<0.01CXCR10.8600.0290.809～0.9232.085<0.01CXCR20.8120.0430.746～0.8557.171<0.01

PCV 息肉狀的病灶主要與色素上皮發(fā)生慢性退行性變、炎癥反應(yīng)有關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)眼局部的一些細(xì)胞因子和趨化因子會(huì)在PCV發(fā)病過程中發(fā)生變化[6-7]。趙敏等[8]研究顯示，PCV發(fā)病過程中，外周血中的趨化因子、血管形成因子均發(fā)生異常。IL-8參與血管內(nèi)皮形成、血管炎癥反應(yīng)，而其是否與PCV有關(guān)，目前未見報(bào)道，因此本研究以IL-8為切入點(diǎn)探索PCV的發(fā)病機(jī)制，為PCV的治療提供新線索和新靶標(biāo)。

IL-8屬于趨化因子家族成員，能夠通過不同方式調(diào)控血管形成。研究證實(shí)，IL-8與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成密切相關(guān)[9]。體外研究顯示，無炎癥發(fā)生情況下，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加IL-8能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖及趨化反應(yīng)[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，IL-8可直接誘導(dǎo)血管形成[11]。另有研究顯示，轉(zhuǎn)染IL-8的腫瘤細(xì)胞可迅速生成新生血管[12]。Choi等[13]認(rèn)為，IL-8為血管形成的重要因子，體外培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡時(shí)，添加IL-8后能夠使凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，此外IL-8能夠刺激內(nèi)皮血管細(xì)胞增殖。以上研究均提示IL-8與血管形成、血管病變密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PCV患者房水中IL-8 mRNA表達(dá)明顯升高，表明房水中IL-8的異?？赡芘cPCV有關(guān)。張亞芳等[14]發(fā)現(xiàn)PCV患者血清中IL-8水平與正常者并無明顯差異，這與本研究結(jié)果不一致，分析原因可能為PCV病變后房水中IL-8進(jìn)入血清后其水平可能受到其他因素影響，因此造成血清IL-8水平無差異。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中IL-8水平與BCVA(LogMAR)、CMT呈顯著正相關(guān)，說明隨著BCVA(LogMAR)、CMT的升高，IL-8分泌升高，提示IL-8表達(dá)與患者視力、視網(wǎng)膜狀況有關(guān)，也可能與PCV的進(jìn)展有關(guān)。Logistic回歸分析顯示，IL-8為PCV發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。以上結(jié)果提示房水中IL-8參與PCV的發(fā)生，且其表達(dá)上調(diào)與視力、視網(wǎng)膜病變程度有關(guān)。

CXCR1、CXCR2基因?yàn)镃XCR家族中的重要成員，均定位于染色體2q35，在單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面表達(dá)[15]。CXCR1和CXCR2均為 IL-8 受體，與IL-8都有高度的親和性，IL-8與CXCR1和CXCR2結(jié)合后通過相互作用，調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，發(fā)揮生物學(xué)功能。CXCR1/2與IL-8結(jié)合被激活使CXCR1/2胞漿區(qū)構(gòu)象改變，隨后G蛋白釋放二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)，活化效應(yīng)蛋白催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)；活化磷脂酶 C將細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)水解成肌醇三磷酸(inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白激酶，升高蛋白質(zhì)磷酸化水平，使效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生遷移、脫離，分泌活性產(chǎn)物，進(jìn)而參與機(jī)體炎癥、血管形成、腫瘤遷移等生理過程。關(guān)于腸道炎癥疾病的研究發(fā)現(xiàn)，IL-8與CXCR2相互作用，進(jìn)而促使炎性細(xì)胞向腸黏膜轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，加速腸道炎癥反應(yīng)[16]。在腫瘤組織中，IL-8與受體CXCR1、CXCR2結(jié)合后可促使微環(huán)境中血管形成，促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[17]。癌細(xì)胞研究顯示，上調(diào)CXCR1/2可增加癌細(xì)胞對(duì)IL-8反應(yīng)性，加速疾病進(jìn)展[18]。采用CXCR1/2拮抗劑G31P封閉CXCR1/2后，可降低IL-8表達(dá)水平，同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力[19]。研究顯示，CXCR1和CXCR2可在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，且在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、燒傷愈合、血管生成中發(fā)揮重要作用[20]。體外移植實(shí)驗(yàn)顯示，CXCR1和CXCR2可在受損皮膚角質(zhì)層表達(dá)，且可通過調(diào)控Th1/Th2調(diào)節(jié)角質(zhì)層細(xì)胞的表達(dá)[21]。然而二者是否與PCV的發(fā)生有關(guān)，目前尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2 mRNA表達(dá)明顯升高，表明房水中IL-8受體CXCR1和CXCR2的異常表達(dá)與PCV可能有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2的表達(dá)水平與BCVA(LogMAR)呈正相關(guān)，與CMT呈正相關(guān)，說明隨著BCVA降低、CMT的升高，CXCR1和CXCR2表達(dá)逐漸升高，提示患者視力、視網(wǎng)膜狀況能夠影響房水中CXCR1和CXCR2的表達(dá)，CXCR1和CXCR2可能與PCV的進(jìn)展有關(guān)。Logistic回歸分析顯示，CXCR1和CXCR2為PCV發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。以上結(jié)果提示房水中CXCR1和CXCR2參與PCV的發(fā)生，且與病程進(jìn)展有關(guān)。此外，ROC曲線分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2診斷PCV的AUC分別0.882、0.860、0.812，提示PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2對(duì)PCV診斷均有一定價(jià)值，可能是PCV的潛在診斷標(biāo)志物。

綜上所述，PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表達(dá)上調(diào)可能與PCV的發(fā)生有關(guān)，有望成為PCV早期診斷及治療的潛在靶點(diǎn)和診斷指標(biāo)。但本研究?jī)H從臨床水平研究IL-8及其受體在PCV診斷中的臨床意義，并未從分子機(jī)制上進(jìn)行深入研究，有待后續(xù)進(jìn)一步探究。