熒光PCR探針熔解曲線技術(shù)檢測涂陽患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌耐藥性的價值

趙國連 崔曉利 康磊 劉元 黨麗云

圖1 患者納入及標(biāo)本處理流程

耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病已成為結(jié)核病預(yù)防和控制的重大難題，對于耐藥結(jié)核病的早期診斷是重中之重。目前，人們對于MTB的發(fā)現(xiàn)及其藥物敏感性的檢測還主要依賴于顯微鏡檢、傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)[1]。然而，相對于痰標(biāo)本抗酸染色陽性率不足、傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏試驗需要時間過長及操作的復(fù)雜性，加之我國絕大多數(shù)基層醫(yī)院缺乏培養(yǎng)條件，導(dǎo)致很大比例的耐藥結(jié)核病患者無法得到及時診斷，延誤臨床有效治療，也增加了耐藥結(jié)核病的傳播風(fēng)險。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)在結(jié)核病診斷中的成熟應(yīng)用，采用分子生物學(xué)技術(shù)對MTB耐藥性的檢測勢在必行[2]。熒光PCR探針熔解曲線法(MeltPro法)檢測培養(yǎng)陽性MTB的耐藥性已獲得了良好的性能驗證[3-4]，然而，其臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步驗證。筆者收集痰涂片陽性結(jié)核病患者的痰標(biāo)本，用MeltPro法對一線和二線常用抗結(jié)核藥物的耐藥性進(jìn)行檢測，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)表型藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行對比，以對其臨床應(yīng)用價值進(jìn)行評估。

材料和方法

一、材料收集

回顧性分析2016年9月至2018年8月西安市胸科醫(yī)院500例涂陽肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本檢測結(jié)果。所有患者痰標(biāo)本量均不少于2 ml，每例患者用同一份痰標(biāo)本進(jìn)行痰涂片鏡檢、BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測，以及采用MeltPro法對MTB耐藥基因進(jìn)行檢測，同時對培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌的分離菌株進(jìn)行表型藥敏試驗。具體患者納入及標(biāo)本處理流程見圖1，最終有441、440、443和442例患者痰標(biāo)本可用于MeltPro法分別檢測利福平(RFP)、異煙肼(INH)、二線注射類藥物(SLID)和氟喹諾酮類(FQ)藥物耐藥性能評估。

二、檢測方法

1.表型藥敏試驗：應(yīng)用萋-尼抗酸染色法對抗酸桿菌進(jìn)行直接涂片鏡檢。將痰標(biāo)本按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行從陰性到“++++”的分級。涂片鏡檢陽性痰標(biāo)本使用N-乙?；?L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化15 min，然后加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)，3000×g離心15 min，將沉淀重新懸浮于2 ml PBS緩沖液中。將0.5 ml處理后標(biāo)本接種在BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長指示管，進(jìn)行混勻，室溫靜置30 min。然后在37 ℃自動BACTEC MGIT 960儀器中孵育，最長時間為42 d，并定期進(jìn)行監(jiān)控。培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)萋-尼抗酸染色確認(rèn)，并進(jìn)一步用MPB64單克隆抗體(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)進(jìn)行測定，鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

培養(yǎng)陽性標(biāo)本中鑒定為MTB的分離株進(jìn)行表型藥敏檢測。其中一線藥物RFP和INH應(yīng)用MGIT 960液體藥敏試驗檢測。RFP藥物濃度為1.0 μg/ml，INH藥物濃度為0.1 μg/ml。二線藥物左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、阿米卡星(Am)和卷曲霉素(Cm)應(yīng)用比例法藥敏試驗。Lfx藥物濃度為2 μg/ml，Mfx藥物濃度為2 μg/ml、Am藥物濃度為30 μg/ml、Cm為40 μg/ml。具體操作按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實(shí)驗室檢驗規(guī)程》[5]進(jìn)行。

2.MeltPro法耐藥基因檢測：將1 ml經(jīng)上述步驟處理過的標(biāo)本應(yīng)用半自動核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)提取核酸。對于RFP、INH和二線注射類抗結(jié)核藥物，分A、B兩個體系進(jìn)行檢測，每個體系分別有FAM和TET通道，共4個通道對耐藥核心區(qū)進(jìn)行檢測。RFP檢測rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域，INH檢測ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))及katG315密碼子；二線注射類抗結(jié)核藥物檢測rrs基因1401、1402、1484位點(diǎn)及eis基因啟動子區(qū)-37、-14、-13、-10位點(diǎn)；對氟喹諾酮類藥物用一個體系一個通道對其耐藥相關(guān)gyrA基因88～94位密碼子進(jìn)行檢測。將5 μl提取后的核酸加入20 μl PCR反應(yīng)液中擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 15 s，退火57 ℃ 20 s，延伸76 ℃ 25 s， 42個循環(huán)；76 ℃延伸5 min。通過比較檢測樣本與陽性對照之間熔解曲線熔點(diǎn)(Tm)的差異判斷是否發(fā)生突變。當(dāng)所有通道中待檢測樣品的熔點(diǎn)和陽性對照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型，試驗菌株對相應(yīng)藥物敏感。4個通道中任意一個通道中樣品的熔點(diǎn)低于陽性對照2 ℃及以上時(≥2 ℃)判定為突變株，試驗菌株對相應(yīng)藥物耐藥[6]。

3.GeneXpert MTB/RIF檢測：將剩余的0.5 ml經(jīng)上述步驟處理后標(biāo)本加入專用處理液至3 ml，劇烈振蕩10～15次，樣品在室溫下靜置15 min。用無菌移液管將2.5 ml樣本轉(zhuǎn)移至檢測匣，并在30 min內(nèi)完成上機(jī)。該技術(shù)通過A、B、C、D、E等5個信標(biāo)探針對結(jié)核分枝桿菌rpoB基因RRDR耐藥核心區(qū)81 bp進(jìn)行檢測。擴(kuò)增程序為預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個循環(huán)的退火過程中進(jìn)行1次熒光檢測。對5條熒光探針循環(huán)閾值(Ct值)進(jìn)行檢測，如果5條熒光探針Ct值均≤40且任意2條探針ΔCt值<3.5，則判定為MTB陽性且對利福平敏感；如果任意2條探針ΔCt值≥3.5則判定為利福平耐藥基因突變。如果有3條及以上熒光探針Ct值均>40，則判斷為未檢測到結(jié)核分枝桿菌[7]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計算MeltPro法及GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌對不同藥物耐藥性的檢測效能，各項指標(biāo)計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值越大說明一致性越好。采用χ2檢驗分析不同痰涂片陽性分級標(biāo)本與MeltPro法耐藥性檢測結(jié)果無效的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

結(jié) 果

一、菌株對RFP耐藥性的檢測

表型藥敏試驗結(jié)果顯示，17.2%(77/447)分離株對RFP耐藥。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MeltPro法測定結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為98.7%(76/77)和94.2%(343/364)。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥的敏感度和特異度分別為94.8%(73/77)和94.0%(342/364)。GeneXpert-MTB/RIF和MeltPro法與表型藥敏試驗結(jié)果一致性均較好(Kappa值均>0.75)，但MeltPro法檢測效能與表型藥敏試驗檢測結(jié)果的一致性更高(Kappa值=0.84)，具體見表1。

表1 MeltPro法與GeneXpert MTB/RIF以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的效能

MeltPro法檢測到的97株RFP耐藥菌株中，61.9%(60/97)的菌株突變發(fā)生在rpoB基因529～533位密碼子，15.5%(15/97)的菌株突變發(fā)生在521～528位密碼子，5.2%(5/97)的菌株突變發(fā)生在507～512位密碼子，1.0%(1/97)的菌株突變發(fā)生在513～520位密碼子。97株耐藥菌株中檢測到16株(16.5%)發(fā)生多位點(diǎn)突變。

GeneXpert MTB/RIF檢測到的95株RFP耐藥菌株中，66.3%(63/95)的菌株突變發(fā)生在rpoB基因528～533位密碼子，15.8%(15/95)的菌株突變發(fā)生在523～527位密碼子，9.5%(9/95)的菌株突變發(fā)生在507～512位密碼子，2.1%(2/95)的菌株突變發(fā)生在512～517位密碼子。未檢測到發(fā)生在518～522密碼子之間的突變菌株。95株耐藥菌株中檢測到6株(6.3%)發(fā)生多位點(diǎn)突變。

二、菌株對INH耐藥性的檢測

通過表型藥敏試驗結(jié)果顯示，28.2%(124/440)的分離株對INH耐藥。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥性的敏感度和特異度分別為82.3%(102/124；95%CI：74.1%～88.3%)和96.2%(304/316；95%CI：93.2%～97.9%),陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為89.5%(102/114)和99.7%(343/344)，Kappa值為0.80。 MeltPro法檢測的114株INH耐藥菌株中，71.1%(81/114)的菌株突變發(fā)生在katG315密碼子區(qū)，14.0%(16/114)的菌株突變發(fā)生在inhA啟動子區(qū)，7.0%(8/114)的菌株突變發(fā)生在ahpC啟動子區(qū)，5.3%(6/114)的菌株突變發(fā)生在inhA94密碼子區(qū)。114株耐藥菌株中檢測到3株(2.6%)發(fā)生多位點(diǎn)突變。

三、菌株對二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測

表型藥敏試驗結(jié)果顯示，2.0%(9/443)的分離株對Am耐藥，1.6%(7/443)的分離株對Cm耐藥。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對Am耐藥性的敏感度和特異度分別為8/9和99.5%(432/434)；檢測Cm耐藥性的敏感度和特異度分別為6/7和99.1%(432/436)，見表2。MeltPro法檢測到的10株二線注射類藥物耐藥株中，9株菌株突變發(fā)生在rrs基因1401A→G/1402C→T，1株菌株突變發(fā)生在rrs基因1473G→A/1473G→T/1484G→T。未檢測到eis基因相關(guān)區(qū)域內(nèi)的突變。

四、菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥性的檢測

表型藥敏試驗結(jié)果顯示，12.0%(53/442)的分離株對Lfx耐藥，9.5%(42/442)的分離株對Mfx耐藥。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度和特異度分別為90.6%(48/53)和99.2%(386/389)；檢測結(jié)核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度和特異度分別為88.1%(37/42)和96.5%(386/400)，見表3。MeltPro 法檢測到的51株氟喹諾酮類藥物耐藥菌株突變均發(fā)生在gyrA基因88～94位密碼子。

表2 以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥的效能

表3 以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的效能

表4 痰涂片陽性分級與MeltPro法耐藥性檢測無效的相關(guān)性

五、痰涂片陽性分級對MeltPro 法耐藥性檢測效能的影響

分析不同痰涂片陽性分級標(biāo)本與MeltPro法耐藥性檢測結(jié)果無效的關(guān)系，顯示MeltPro法檢測無效率隨痰標(biāo)本分級的增加而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=52.01，P<0.01)，其中痰涂片分級為1～8條/300個視野的患者M(jìn)eltPro法檢測無效率最高，達(dá)9.3%(表4)。

討 論

分子生物學(xué)檢測技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的檢測為結(jié)核病的早診早治提供有力的輔助。筆者首次評估MeltPro法在臨床痰標(biāo)本中診斷耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的價值，結(jié)果顯示其對6種常見抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測具有較好的檢測效能。

研究顯示，GeneXpert MTB/RIF和博奧基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥性的敏感度分別為87.10%和89%，均低于本次研究MeltPro法的98.7%[8-9]。本次研究結(jié)果顯示MeltPro法與表型藥敏試驗結(jié)果的一致性高于GeneXpert MTB/RIF，并且MeltPro法操作簡便，結(jié)果可靠。MeltPro法與基因芯片檢測結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)MeltPro法檢測覆蓋了rpoB基因507～533位共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)全部81個核苷酸，而基因芯片技術(shù)只檢測rpoB基因常見的6個突變位點(diǎn)，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，而對于此6個位點(diǎn)以外的突變無法識別；(2)GeneXpert MTB/RIF檢測也覆蓋了rpoB基因507～533位共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)全部81個核苷酸，但當(dāng)待測標(biāo)本同時存在敏感和耐藥細(xì)菌時，會導(dǎo)致擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)，系統(tǒng)會判斷結(jié)果為野生型，從而導(dǎo)致耐藥菌的漏檢。MeltPro法能夠清晰地辨別異質(zhì)性耐藥，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)同時存在敏感菌和耐藥菌時，能夠在結(jié)果呈現(xiàn)2個不同的峰線。研究表明，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中超過5%的細(xì)菌對RFP耐藥時，通過高分辨率熔解曲線技術(shù)就可以檢測到[10]。因此，MeltPro法對于混合感染的檢測可能更有助于實(shí)驗室工作人員對耐藥結(jié)核病的鑒別診斷。

本次研究中，MeltPro法和GeneXpert MTB/RIF對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥rpoB基因507～533位共27個氨基酸密碼子檢測的突變位點(diǎn)分布大致相同，以MeltPro法的B-TET通道529～533位密碼子及GeneXpert MTB/RIF的E探針528～533位密碼子突變率最高，均大于60%。這與Singh等[11]報道的531位密碼子突變率(72.9%)，以及林明冠等[12]報道的 531位密碼子突變率(56.8%)一致。其次為包含516位密碼子的區(qū)域。此結(jié)果說明結(jié)核分枝桿菌對于RFP耐藥相關(guān)基因的突變位點(diǎn)分布目前來看各地差異性不大，但對其不常見突變位點(diǎn)的補(bǔ)充檢測也是提高檢測敏感度的重要手段。

本研究對菌株INH耐藥性檢測的敏感度為82.3%，與Xie等[4]和Pang等[6]應(yīng)用同種方法得出的結(jié)果相近，分別為83.3%和84.9%。相比Pang等[13]和張俊仙等[14]研究基因芯片法對INH耐藥基因檢測敏感度更高。究其原因，MeltPro法對INH耐藥的檢測靶點(diǎn)較以往常用的katG基因及inhA基因啟動子外新增了ahpC啟動子區(qū)(-44～-30及-15～3位點(diǎn))和inhA94密碼子區(qū)域。本次研究結(jié)果顯示，這2個新增位點(diǎn)的突變率分別為7.0%和5.3%，而傳統(tǒng)的katG基因及inhA基因啟動子只能檢測到85%的突變率?？梢娦略龅耐蛔兿嚓P(guān)位點(diǎn)的檢測對INH耐藥性檢測有重要意義。

本次研究顯示，MeltPro法檢測結(jié)核分枝桿菌對Am和Cm耐藥性的敏感度分別為88.9%和85.7%。檢測Am耐藥性的敏感度略高于Pang等[6]的75%以及Tomasicchio等[15]應(yīng)用GenoType MTBDRsl方法檢測的72.9%。檢測Cm耐藥性的敏感度與Gardee等[16]應(yīng)用GenoType MTBDRsl檢測的敏感度[86.2%(95%CI：68.3%～96.1%)]相近。對于突變位點(diǎn)的分布，結(jié)果顯示都集中在rrs基因1401位點(diǎn)。這與Georghiou等[17]報道的rrs基因A1401G突變可以覆蓋75%以上Am和Cm的耐藥菌株一致。本研究對二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥性檢測不足之處在于包含的廣泛耐藥菌株太少，分別只有9例和7例，雖然整體敏感度結(jié)果與其他研究[16]相一致，但敏感度的95%CI值下限較低。此外，不同于以上兩篇報道[15-16]對Am和Cm使用的MGIT 960液體藥敏試驗法，本研究對這2種藥物采用的是固體比例法藥敏試驗。不同的藥敏試驗方法對表型耐藥結(jié)果可能也有一定的影響。

本研究顯示，MeltPro 法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx和Mfx耐藥性的敏感度分別為90.6%和88.1%。張治國等[18]和Xie等[4]均報道gyrA不同類型突變的結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥水平有一定影響。部分菌株出現(xiàn)gyrA基因A90V或S91P突變，當(dāng)Mfx濃度為0.5 μg/ml時表型藥敏試驗結(jié)果為耐藥，而Mfx濃度為2 μg/ml時，表型藥敏試驗結(jié)果為敏感。筆者應(yīng)用的是2 μg/ml的藥物濃度，所以有可能會有部分發(fā)生突變的菌株表型藥敏試驗結(jié)果為敏感。

本次研究顯示，MeltPro 法檢測到的51株氟喹諾酮類藥物耐藥菌株突變均發(fā)生在gyrA基因。本次研究主要檢測氟喹諾酮類藥物耐藥菌株gyrA基因88～94位密碼子(主要是gyrA88、gyrA90、gyrA91和gyrA94)；缺少對gyrB基因的檢測。李國利等[19]報道顯示，結(jié)核分枝桿菌gyrB基因單獨(dú)突變引起的氟喹諾酮類藥物耐藥占總耐藥的1.5%。雖然gyrB基因發(fā)生突變頻率比gyrA突變低，但增加gyrB基因檢測對菌株氟喹諾酮類藥物耐藥性的檢測有一定的必要性。

本次研究顯示，MeltPro 法也存在一定不足，對于部分陽性標(biāo)本出現(xiàn)檢測結(jié)果無效。通過對痰標(biāo)本陽性分級與MeltPro 法檢測結(jié)果無效的相關(guān)性分析顯示，檢測無效率與標(biāo)本細(xì)菌載量呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)標(biāo)本菌含量較低時，本方法的耐藥基因檢測限不足，出現(xiàn)耐藥性不明確的現(xiàn)象。此外，如果原始標(biāo)本含有較大比例的血液或者食物殘渣等雜質(zhì)時，核酸提取過程中未經(jīng)過有效的前處理會導(dǎo)致所提取的核酸模板純度不足，出現(xiàn)反應(yīng)抑制。所以對于合格標(biāo)本源的控制及方法學(xué)的改進(jìn)都是提高耐藥基因突變檢測敏感度的重要手段。