2012—2017年湖南省非結(jié)核分枝桿菌感染的特征分析

陳忠南 易松林 胡培磊 郭靖瑋 余艷艷 劉彬彬 易環(huán) 楊坤云 譚云洪

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)系指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。目前，歐美國(guó)家和亞洲國(guó)家NTM肺病的發(fā)病率逐年上升，包括我國(guó)在內(nèi)的亞洲地區(qū)，NTM的感染率也在上升[1]。NTM肺病具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損傷表現(xiàn)，主要侵犯肺部。在無(wú)菌種鑒定結(jié)果的情況下，痰涂片抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)難以區(qū)別NTM和結(jié)核分枝桿菌，造成痰涂片抗酸染色或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者誤診為結(jié)核病而持續(xù)地給予抗結(jié)核藥物治療，甚至誤診為耐藥結(jié)核病而長(zhǎng)期給予耐多藥結(jié)核病方案進(jìn)行治療[2]。 NTM的分布具有明顯的地域差異，不同地區(qū)的感染率、發(fā)病率和流行菌種各有特點(diǎn)[3]。筆者參考《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]、《非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定技術(shù)》[5]對(duì)2012—2017年湖南省經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)分離出的分枝桿菌菌株采用MPB64蛋白免疫膠體金法、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行MTBC與NTM初步鑒別，應(yīng)用16S rRNA、Hsp65測(cè)序法將NTM鑒定到種水平，分析NTM感染患者的相關(guān)臨床資料，以了解湖南省NTM的菌種分布、流行狀況及趨勢(shì)，為 NTM肺病的疫情監(jiān)測(cè)及制定防控策略提供科學(xué)依據(jù)，以適應(yīng)臨床診治工作的需要。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集2012—2017年來(lái)自湖南省14個(gè)地級(jí)市、經(jīng)湖南省胸科醫(yī)院行BACTEC MGIT 960 法確診為分枝桿菌感染的患者15 576例，其中男性11 126例，女性4450例。分離出分枝桿菌菌株15 576株(每例患者1株)。H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

二、試劑與儀器

4%NaOH、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]的規(guī)程由科室自配；BACTEC MGIT 960分枝桿菌分析系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱MGIT 960)及其配套試劑MGIT 試管(含7H9 液體培基)、油酸-白蛋白-右旋糖-過(guò)氧化氫酶(OADC)添加劑(含營(yíng)養(yǎng)液)、雜菌抑制劑購(gòu)自美國(guó) BD公司；萋-尼抗酸染色試劑、改良羅氏培養(yǎng)基、PNB培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(MPB64蛋白免疫膠體金法)購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。采用16S rRNA和Hsp65兩個(gè)同源序列分析及斑點(diǎn)雜交方法將NTM鑒定到種水平，引物合成及測(cè)序由北京瑞博生物有限公司完成，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

三、研究方法

(一)MGIT 960分離培養(yǎng)

培養(yǎng)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行，儀器報(bào)陽(yáng)培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行萋-尼抗酸涂片染色，抗酸染色陽(yáng)性報(bào)告“分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性”。

(二)MTBC與NTM初步鑒定

1.MPB64蛋白免疫膠體金法：MGIT 960 系統(tǒng)分離培養(yǎng)的陽(yáng)性菌株直接應(yīng)用其液體培養(yǎng)基上清液進(jìn)行檢測(cè)。吸取上述待測(cè)菌液 0.1 ml 加入試劑檢測(cè)板上的加樣孔，15～60 min觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為陽(yáng)性；檢測(cè)線未出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)弱紫紅色條帶，判定為疑似陽(yáng)性；檢測(cè)線未出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為陰性；檢測(cè)線和質(zhì)控線雙方均未出現(xiàn)紫紅色條帶，判定為無(wú)效。

2. PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)：取100 μl經(jīng)MPB64蛋白免疫膠體金法鑒定為陰性的MGIT 960 系統(tǒng)分離培養(yǎng)陽(yáng)性菌液，接種于改良羅氏培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基生長(zhǎng)管內(nèi)，置入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。改良羅氏培養(yǎng)基有分枝桿菌生長(zhǎng)、PNB培養(yǎng)基無(wú)分枝桿菌生長(zhǎng)為MTBC；改良羅氏培養(yǎng)基與PNB培養(yǎng)基均有分枝桿菌生長(zhǎng)為NTM。

(三)NTM菌種鑒定

由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，且部分菌株丟失，對(duì)初步鑒定為NTM的菌株全部開展菌種鑒定工作始于2016年，具體操作步驟如下：

1．細(xì)菌DNA的制備：用接種環(huán)取改良羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分枝桿菌1～2環(huán)菌落，溶于500 μl生理鹽水中，85 ℃滅活20 min；離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，菌體沉淀用500 μl 無(wú)菌純水中重懸洗滌；然后離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 μl無(wú)菌純水，95 ℃ 金屬浴10 min，之后超聲處理15 min。離心半徑8.5 cm，12 000 r/min 離心5 min，取上清備用(-20 ℃ 冷凍保存)。

2. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及分子測(cè)序技術(shù)：采用16S rRNA、Hsp65兩對(duì)引物擴(kuò)增，16S rRNA上游引物為：5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAA-GG-3′；下游引物為5′-GCCCGTA-TCGCCCGCACGCT-3′。Hsp65上游引物: 5′ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′，下游引物: 5′-CTTGTC-GAACCGCATACCCT-3′，由北京瑞博生物有限公司合成。16S rRNA產(chǎn)物800 bp, Hsp65產(chǎn)物400 bp；PCR反應(yīng)體系 50 μl：上游、下游引物各 1.5 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 20 μl，DNA 2 μl，同時(shí)取兩管PCR反應(yīng)管分別加入結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性質(zhì)控品和結(jié)核分枝桿菌陰性質(zhì)控品。按如下程序擴(kuò)增：預(yù)變性95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán); 變性94 ℃ 35 s，退火60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 8 min，1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描攝影，條帶需明亮單一，否則進(jìn)一步純化。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京瑞博生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用生物數(shù)據(jù)分析軟件(BLAST)將測(cè)序得到的基因序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做同源性比較，相似度≥97%即可確定菌種。

3. 斑點(diǎn)雜交技術(shù)：測(cè)序失敗菌株則應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司研制的分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)方法為斑點(diǎn)雜交法，具體操作步驟參照說(shuō)明書。

結(jié) 果

一、NTM的分離情況

分離培養(yǎng)出15 576株分枝桿菌菌株中，MPB 64抗原檢測(cè)陽(yáng)性13 550株、陰性2026株，經(jīng)PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定后，MPB64抗原陰性標(biāo)本中鑒定出NTM 1584株、MTBC 442株。2012—2017年NTM檢出率見表1。

二、 NTM感染者性別、年齡、職業(yè)分布

2012—2017年湖南省14個(gè)地級(jí)市NTM感染者中，男性占62.06%(983/1584)，女性占37.94%(601/1584)，且各年NTM感染者均為男性多于女性；各年齡組NTM感染者分布顯示，40～歲的中老年患者為感染高峰人群(39.02%，618/1584)；各類職業(yè)分布顯示，NTM感染者均以農(nóng)民為主(66.67%，1056/1584)，見表2。

表1 2012—2017年湖南省14個(gè)地級(jí)市NTM檢出情況

三、NTM菌種分布特征

2016年共鑒定出333株NTM及3例MTBC與NTM混合感染。333株NTM菌種分布達(dá) 24種，菌種分布位列前4者分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥分枝桿菌，分別占25.23%、24.62%、18.62%、16.82%(表3)。其他49株(14.71%)NTM，包含20種NTM，分別為偶發(fā)分枝桿菌9株，蟾蜍分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌各5株，緩黃分枝桿菌、新金分枝桿菌各4株，外來(lái)分枝桿菌、三重分枝桿菌各3株，馬賽分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌各2株，另10種分枝桿菌各1株。3例混合感染者，分別為結(jié)核分枝桿菌+膿腫分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌+胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌+蟾蜍分枝桿菌。

2017年NTM菌種共有383株，包括21種類型，菌種分布位列前4者仍然為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌，鳥分枝桿菌，分別占27.15%，22.46%，21.15%，17.49%(表3)。其他45株(11.75%)NTM，包含17種NTM，分別為偶發(fā)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌各8株，瘰疬分枝桿菌6株，堪薩斯分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、塞內(nèi)加爾分枝桿菌各3株，摩納哥分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、新金分枝桿菌各2株，另8種分枝桿菌各1株。

討 論

NTM廣泛存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，其中部分為致病菌或條件致病菌，目前NTM肺病的發(fā)病率及流行率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[7]。由于NTM肺病無(wú)傳染性，大多數(shù)國(guó)家并不強(qiáng)制報(bào)告，因此監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)不僅有限且不可靠[8]。陳闖等[9]通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的2010年前后NTM感染相關(guān)論文得出，除了浙江省、廣東省的 NTM 檢出率高于 20%外，其他地區(qū)的NTM檢出率均低于20%；其中上海市、陜西省、河北省、四川省的 NTM 檢出率雖處于較高水平，但也僅在 10%左右，而山東省、云南省、西藏、新疆、河南省、湖北省，以及哈爾濱市和吉林市等東北地區(qū)報(bào)告的 NTM 檢出率僅為5%左右。本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，近6年湖南省14個(gè)地級(jí)市NTM檢出率為10.17%，處在全國(guó)較高水平。

表2 NTM感染者不同特征在2012—2017年的分布情況

表3 NTM不同菌種類型在2016—2017年中的分布情況

近年來(lái)，NTM 的臨床實(shí)驗(yàn)室檢出率有所增加，這與現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)方法的快速鑒別診斷密切相關(guān)。隨著免疫檢測(cè)技術(shù)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，NTM的鑒定技術(shù)也取得很大的進(jìn)步。但目前我國(guó)對(duì)NTM的診斷沒(méi)有建立早期、快速、敏感和特異的標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)[8]。傳統(tǒng)PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒別MTBC與NTM的能力較強(qiáng)，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且不能將NTM鑒定到種水平[4]。MPB64 蛋白免疫膠體金法的檢測(cè)原理是利用MPB64抗原是MTBC在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)主要的分泌蛋白之一，NTM在培養(yǎng)濾液中多不存在此分泌蛋白，由此將MTBC與NTM進(jìn)行初步的菌種鑒定[5]。MPB64蛋白免疫膠體金法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、不需特殊設(shè)備，但也存在部分結(jié)核分枝桿菌不分泌MPB64蛋白，因此有部分MTBC的MPB64抗原檢測(cè)呈陰性[10]。本研究采用MPB64蛋白免疫膠體金法將分枝桿菌快速鑒別出大部分MTBC，同時(shí)應(yīng)用PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定出NTM及少部分MPB64抗原呈陰性的MTBC。本研究在進(jìn)行分枝桿菌初步鑒定時(shí)采用MPB64蛋白免疫膠體金法與PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)兩種方法結(jié)合，既節(jié)省了大部分分枝桿菌的初步鑒定時(shí)間，又防止部分MPB64呈陰性的MTBC被誤診為NTM。2013年之前我院對(duì)MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)物主要靠抗酸染色涂片，存在部分NTM被誤診為MTBC的情況；采用MPB64蛋白免疫膠體金法與PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)兩種方法對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定可以減少誤診和漏診。

本研究發(fā)現(xiàn)2012—2017年NTM感染者均以男性為主，這與羅春明等[11]和楊栗坤等[12]的研究結(jié)果一致。另外，2012—2017年間NTM感染患者主要為>40歲的中老年農(nóng)民，出現(xiàn)這種情況的原因可能為NTM 廣泛存在于自然界，人與某些動(dòng)物均可從環(huán)境中感染NTM而致病，水和土壤是重要的傳播途徑[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道表明，感染NTM的危險(xiǎn)因素與男性吸煙、人口老齡化、免疫抑制人群增多及環(huán)境暴露等因素有關(guān)[13]。

本研究依據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]、應(yīng)用16S rRNA、Hsp65測(cè)序法進(jìn)行菌種鑒定?？紤]到部分測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，有可能存在混合感染現(xiàn)象[14]，故采用斑點(diǎn)雜交法再次檢測(cè)出現(xiàn)雙峰的標(biāo)本。2016、2017年菌種鑒定結(jié)果顯示，菌種分布達(dá) 24種，位列前4者分別為：胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌，鳥分枝桿菌，這與我院2011年的分析數(shù)據(jù)[15]及福建省[16]、浙江省[17]的菌種分布類似。同時(shí)采用斑點(diǎn)雜交法鑒定出3例混合感染，為臨床難治性混合感染患者的進(jìn)一步治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。段鴻飛[18]研究認(rèn)為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌為致病菌,分離出戈登分枝桿菌有可能是患者標(biāo)本被NTM污染且并不致病。因此，對(duì)于湖南省14個(gè)市檢出的戈登分枝桿菌是否為標(biāo)本污染菌、是否導(dǎo)致疾病，還需做進(jìn)一步的深入研究。

筆者單位作為全省的結(jié)核病防治定點(diǎn)?？漆t(yī)院，具有來(lái)自全省14個(gè)地級(jí)市的大樣本，且初步總結(jié)了近6年內(nèi)NTM的檢出率、易感人群，以及近2年的NTM菌種分布特征，因此本研究可為了解湖南省NTM的感染現(xiàn)狀提供一定的參考依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，由于受當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)人員不熟悉菌種測(cè)序工作及菌株未保存完整等實(shí)驗(yàn)條件的限制，我院只在2016年之后將全部NTM菌株鑒定到種水平。因此，為更好地做好NTM感染的防治工作，還需繼續(xù)監(jiān)測(cè)湖南省NTM感染的菌種分布情況。