加強(qiáng)結(jié)核病耐藥性檢測(cè)研究提高正確解讀檢測(cè)結(jié)果水平

吳雪瓊

全球結(jié)核病疫情下降緩慢，根據(jù)WHO 2018年報(bào)告，2017年全球仍有1000萬(wàn)例結(jié)核病患者、45.76萬(wàn)例耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者和10.04萬(wàn)例單耐利福平(RFP)結(jié)核病患者，130萬(wàn)例患者死于結(jié)核病[1]。中國(guó)的結(jié)核病疫情也相當(dāng)嚴(yán)重，占全球結(jié)核病患者的9%，僅次于印度(27%)；全球耐利福平結(jié)核病(RR-TB)/MDR-TB將近50%發(fā)生在印度(24%)、中國(guó)(13%)和俄羅斯(10%)[1]，由此可見(jiàn)，耐藥結(jié)核病的快速診斷和治療對(duì)于我國(guó)結(jié)核病的控制是至關(guān)重要的。

目前，結(jié)核分枝桿菌(MTB)表型藥物敏感性試驗(yàn)(DST)的敏感度低、耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足臨床耐藥結(jié)核病早期診斷、有效治療的需要。分子DST方法的建立和臨床應(yīng)用，以其簡(jiǎn)便、快速、高敏感和強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)已成為耐藥結(jié)核病快速診斷的重要手段[2]。但是，目前DST檢測(cè)流程尚不規(guī)范，對(duì)分子DST檢測(cè)的認(rèn)識(shí)尚不全面?！吨袊?guó)防癆雜志》編輯部于2018年8月3日在內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市召開(kāi)了耐藥MTB檢測(cè)共識(shí)討論會(huì)，形成《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)專家共識(shí)》[3]，以期闡明問(wèn)題之所在，探索解決之辦法，指導(dǎo)臨床之應(yīng)用。筆者將重點(diǎn)探討耐藥MTB檢測(cè)的進(jìn)展、存在的問(wèn)題和未來(lái)發(fā)展的前景。

耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的主要進(jìn)展

1.耐藥性檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展：1931年L?wenstein[4]和1932年Jensen[5]發(fā)明了羅氏培養(yǎng)基；改良羅氏培養(yǎng)基的問(wèn)世，如建立于固體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的DST絕對(duì)濃度法、比例法和硝酸鹽還原試驗(yàn)為耐藥結(jié)核病的診斷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6-7]。Middlebrook和Cohn[8-9]發(fā)明了Middlebrook系列的液體和固體培養(yǎng)基，如建立于瓊脂固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上的DST較改良羅氏培養(yǎng)基的DST縮短了時(shí)間；而建立于液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上的DST如以放射性14C棕櫚酸為基底物的半自動(dòng)BACTEC TB460[10]、以釕(Ruthenium)為熒光底物的全自動(dòng)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)[11]、英國(guó)Biotec Laboratories公司開(kāi)發(fā)的MTB快速診斷試劑盒噬菌體法(FASTPlaque TBTM)[12]、顯微鏡觀察DST(MODS)[13]，以及近年來(lái)在臨床應(yīng)用的最低抑菌濃度(MIC)法[14]，均較固體培養(yǎng)DST(3～4周)明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間(10 d左右)。還有一些新的依賴于MTB生長(zhǎng)的快速DST方法的建立，如E-test (epsilometer test) DST[15]、流式細(xì)胞術(shù)DST[16]、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光DST檢測(cè)法[17]、顯微鏡延時(shí)成像的MTB瓊脂糖快速DST[18]等，但并未在臨床應(yīng)用。20世紀(jì)80年代分子雜交技術(shù)、基因擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)明和MTB耐藥分子機(jī)制的闡明，建立了一系列耐藥相關(guān)基因突變檢測(cè)技術(shù)[如：基因測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、單鏈探針?lè)聪螂s交試驗(yàn)、基因芯片技術(shù)、RNA:RNA錯(cuò)配試驗(yàn)、PCR-雙脫氧指紋圖譜、異源雙鏈分析、變性梯度凝膠電泳和恒變性劑凝膠電泳等]，使DST進(jìn)入了分子檢測(cè)時(shí)代，其耐藥性檢測(cè)速度更加快速，只需1～2 d時(shí)間[19]；近年來(lái)不依賴于分子雜交的更加簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化的檢測(cè)技術(shù)(如：半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)[20]、熒光PCR探針熔解曲線法[21])的問(wèn)世，使耐藥性檢測(cè)時(shí)間縮短至2～3 h。全基因組測(cè)序(WGS)為耐藥結(jié)核病患者的臨床管理提供了新的機(jī)遇[22]。

2.檢測(cè)藥物種類的增多：從檢測(cè)異煙肼(INH)和RFP耐藥性擴(kuò)展到鏈霉素(Sm)和乙胺丁醇(EMB)；從一線抗結(jié)核藥物發(fā)展到二線抗結(jié)核藥物的氟喹諾酮類(FQs)和注射類藥物[如：卡那霉素(Km)、阿米卡星(丁胺卡那霉素，Am)、卷曲霉素(Cm)]，實(shí)現(xiàn)了MDR-TB、廣泛耐藥前結(jié)核病(pre-XDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的快速診斷[2]。部分新抗結(jié)核藥物的DST也已問(wèn)世[2]。

3.檢測(cè)標(biāo)本的擴(kuò)展：分子DST從檢測(cè)分離株、培養(yǎng)物擴(kuò)展到涂陽(yáng)痰標(biāo)本，從涂陰痰標(biāo)本的篩查發(fā)展到肺外標(biāo)本的檢測(cè)，提高了涂陰耐藥肺結(jié)核(PTB)和肺外耐藥結(jié)核病的診斷率[23]。

4.檢測(cè)策略的變革：從早期的絕對(duì)濃度法到與比例法并存；從固體DST到液體DST；從表型DST到與分子DST聯(lián)用；從單一對(duì)RFP的篩查到對(duì)多個(gè)一線、二線抗結(jié)核藥物的檢測(cè)。

DST診斷表現(xiàn)及存在的問(wèn)題

國(guó)內(nèi)外不同醫(yī)院采用的MTB DST方法和試劑盒并不完全相同，目前已有多個(gè)商業(yè)化的MTB耐藥性檢測(cè)試劑盒在臨床應(yīng)用(表1)，其診斷表現(xiàn)也有一定的差異。目前，耐藥MTB檢測(cè)的臨床意義尚存在許多不一致的觀點(diǎn)，需進(jìn)一步探討、驗(yàn)證。

1. 表型和分子DST并非都可靠：MTB分子DST比表型DST更可靠，是因?yàn)榉肿覦ST受操作因素影響小，只要注意操作規(guī)范、避免核酸污染，一旦檢出基因突變一般均是客觀存在的，與基因測(cè)序的符合率在95%以上；而表型DST無(wú)論是絕對(duì)濃度法還是比例法，檢測(cè)結(jié)果均受操作的影響因素多，如MTB活性、接種菌量、藥物濃度、藥物在培養(yǎng)基中的降解程度和結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性等。一般低水平耐藥時(shí)易出現(xiàn)表型和分子DST結(jié)果的不一致。目前無(wú)論是表型DST還是分子DST檢測(cè)利福霉素類耐藥性的可靠性均最高，其次是INH，第三是FQs，第四是二線注射類藥物[24]。其他抗結(jié)核藥物表型DST和(或)分子DST的診斷效能差異很大，吡嗪酰胺表型DST和藥物濃度缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，需結(jié)合結(jié)核病患者的治療史和臨床表現(xiàn)綜合判斷。

2. 臨床所用DST方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：正確認(rèn)識(shí)每種DST方法的優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)臨床需求合理選擇、組合應(yīng)用，如實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)或PCR-探針熔

表1 不同類別DST技術(shù)與方法檢測(cè)MTB耐藥性的比較

注FQs：氟喹諾酮類；BSL-II：生物安全二級(jí)

解曲線方法可簡(jiǎn)便、快速、高敏感度地直接篩查臨床標(biāo)本中的耐藥MTB，對(duì)于涂陰耐藥結(jié)核病的早期診斷非常有益；單鏈探針?lè)聪螂s交試驗(yàn)、基因芯片可了解突變位點(diǎn)和性質(zhì)，可避免檢出與耐藥無(wú)關(guān)位點(diǎn)突變而導(dǎo)致的假陰性；應(yīng)用固體的表型DST可檢測(cè)藥物的范圍廣，是對(duì)二線抗結(jié)核藥物的敏感性結(jié)果了解的主要依據(jù)。

3. 異質(zhì)性耐藥是客觀存在的現(xiàn)象[25]：結(jié)核病患者體內(nèi)通常敏感菌和耐藥菌并存，只是所占比例不同。一般初治結(jié)核病患者，敏感菌比例高于耐藥菌，有效治療1～2個(gè)月后，敏感菌株逐漸被殺滅，耐藥菌株逐漸占優(yōu)勢(shì)，DST可能由敏感轉(zhuǎn)為耐藥。比例法DST在含有1%的耐藥MTB時(shí)即可檢出；而分子DST需在臨床標(biāo)本中含有較高比率(20%～40%)的耐藥MTB才能檢出，其檢測(cè)耐藥菌的敏感度低于傳統(tǒng)DST。因此，會(huì)出現(xiàn)表型DST與分子DST結(jié)果不一致，或同時(shí)檢出敏感基因型和耐藥基因型的現(xiàn)象。當(dāng)耐藥菌比率較低時(shí)，雖然檢出對(duì)某藥物耐藥，臨床依然應(yīng)用該藥物進(jìn)行治療時(shí)早期會(huì)有效，但隨著敏感菌株逐漸被殺滅，耐藥菌株逐漸占優(yōu)勢(shì)，患者病情會(huì)反復(fù)或復(fù)發(fā)。療程中應(yīng)定期進(jìn)行藥物的耐藥性檢測(cè)，并及時(shí)調(diào)整化療方案。

4. 應(yīng)充分了解分子DST結(jié)果并加以正確解讀：表型DST可提供定性結(jié)果(如敏感或耐藥)，而分子DST結(jié)果并非簡(jiǎn)單地指示耐藥和敏感，應(yīng)正確理解其如下深層次的臨床含義。

1)rpoB基因531、526和513位密碼子突變通常導(dǎo)致RFP、利福噴丁(Rft)高水平耐藥；514和533位密碼子突變一般導(dǎo)致低水平耐藥；507～509、517、523、532位氨基酸置換與耐RFP無(wú)關(guān)[26]。RFP與Rft、利福布汀(Rfb)有70%～90%的交叉耐藥率，故對(duì)RFP耐藥時(shí)一般不再采用Rft和Rfb。RR-TB 通常采用短療程的治療方案[25]。但Rfb的耐藥程度通常較RFP低，而且易進(jìn)入組織、細(xì)胞內(nèi)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗菌活性較RFP強(qiáng)。

2)我國(guó)50%～70%的INH耐藥是katG基因315位突變所致，該突變導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性降低，催化INH轉(zhuǎn)換為其活性型異煙酸的效率降低，表型DST通常表現(xiàn)為MTB對(duì)INH低水平耐受或敏感[27]。若患者對(duì)INH的耐受性較好，臨床上加大INH劑量仍能較好地發(fā)揮抗結(jié)核作用，故建議不要輕易放棄這個(gè)有效的殺菌藥。由于PAS阻滯INH的乙酰化，可間接地提高INH的血藥濃度，因此臨床上也可將INH與PAS聯(lián)合應(yīng)用；也可更換為異煙酸衍生物丙硫異煙胺(Pto)或乙硫異煙胺(Eto)。此外，katG基因315位突變的MTB菌株毒力減弱，對(duì)通過(guò)“氧化殺滅”機(jī)制殺菌的二線抗結(jié)核藥物(如氨基糖苷類藥物)敏感，應(yīng)用二線抗結(jié)核藥物治療會(huì)更有效[28]。

3)inhA-15位突變會(huì)導(dǎo)致INH與Pto、Eto產(chǎn)生交叉耐藥性[29]，在該基因突變的情況下若要將INH更換為Pto或Eto，應(yīng)參考表型DST的結(jié)果。

4)EMB進(jìn)行表型DST的檢測(cè)結(jié)果不可靠，建立其基礎(chǔ)上的分子DST也不可靠，兩者一致性差。對(duì)embB基因306位密碼子突變進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的敏感度低，并且其檢測(cè)結(jié)果為耐藥者在部分表型DST檢測(cè)時(shí)為敏感。對(duì)EMB的DST不可靠的原因是：MTB對(duì)EMB耐藥除了多個(gè)靶基因突變所致外，其作用靶標(biāo)embABC表達(dá)增高也會(huì)導(dǎo)致不同程度的耐藥，而且其表達(dá)受多種因子的調(diào)控[30]。EMB作用靶標(biāo)表達(dá)增高所致耐藥的患者，加大EMB用量治療仍有效。

5)gyrA突變通常導(dǎo)致MTB對(duì)氧氟沙星(Ofx)和左氧氟沙星(Lfx)中、高水平耐藥；而gyrB突變通常導(dǎo)致低耐FQs[31]。FQs各藥物之間呈現(xiàn)不完全的雙向交叉耐藥性，最有效的FQs藥物選擇次序?yàn)椋篗fx=加替沙星(Gfx)>Lfx>Ofx=環(huán)丙沙星(CIP)[32]。

6)若Rrs基因突變，應(yīng)認(rèn)識(shí)到MTB對(duì)Sm、Km、Am和Cm通常存在不同程度的交叉耐藥性[33]。

7)在解讀耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果時(shí)，應(yīng)區(qū)分2種多態(tài)性類型：一種是確實(shí)產(chǎn)生耐藥性的多態(tài)性；另一種是譜系界定或其他與耐藥性無(wú)關(guān)的系統(tǒng)遺傳學(xué)的重要變異(如kat463)。

5. 對(duì)MTB耐藥性檢測(cè)尚存在不同的觀點(diǎn)：為此需進(jìn)一步做深入研究與討論，以達(dá)成共識(shí)。

1)對(duì)于初治結(jié)核病患者早期無(wú)需進(jìn)行DST，也無(wú)需根據(jù)DST結(jié)果制定化療方案。(1)正方：對(duì)于初治結(jié)核病患者，不必過(guò)早進(jìn)行DST，更無(wú)須立即根據(jù)耐藥結(jié)果更換藥物；如果荷菌量很大，經(jīng)過(guò)積極、足量的標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療無(wú)效(臨床耐藥)才考慮為原發(fā)耐藥。如果抗結(jié)核藥物治療有效且效果很好，則不必理會(huì)DST結(jié)果是否耐藥。因此，對(duì)于初治患者，除非顯示出明顯的臨床耐藥表現(xiàn)，均無(wú)需根據(jù)DST進(jìn)行更換藥物處理，否則會(huì)極大影響對(duì)患者的整體療效。(2)反方：由于我國(guó)對(duì)耐藥結(jié)核病患者未實(shí)行隔離、治療的策略，導(dǎo)致耐藥MTB傳播，初治結(jié)核病患者原發(fā)耐藥增多。不對(duì)初治結(jié)核病患者早期進(jìn)行DST，也不根據(jù)DST結(jié)果制定化療方案，必將使耐藥的初治結(jié)核病患者治療效果不佳、甚至無(wú)效，使耐藥情況更加嚴(yán)重，病情惡化，后期治療更加困難[34]。初治結(jié)核病患者即使檢出耐藥，其耐藥菌所占比例可能也低于復(fù)治結(jié)核病患者，這也是耐藥初治結(jié)核病患者應(yīng)用敏感化療方案早期也可能治療有效的原因。

2)初治結(jié)核病患者1次分子DST檢測(cè)RFP、INH、QFs為耐藥時(shí)，是否需要復(fù)查？(1)正方：根據(jù)結(jié)核病耐藥流行病學(xué)資料，初治結(jié)核病耐藥率低，因此，建議初治結(jié)核病患者1次分子DST檢測(cè)為耐藥時(shí)，無(wú)論何種藥物均需要復(fù)查。(2)反方：①患者體內(nèi)通常敏感菌和耐藥菌并存，分子DST方法需臨床標(biāo)本中含有較高比率(20%～40%)的耐藥MTB才能檢出，其檢測(cè)耐藥菌的敏感度低于傳統(tǒng)DST的比例法(僅含1%耐藥菌即可)；②分子DST方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性均高于表型DST，而且檢測(cè)RFP、INH、FQs耐藥性的特異度較高；③當(dāng)前原發(fā)耐藥率增高[1]；④如果分子DST復(fù)查為藥物敏感，也不能說(shuō)明標(biāo)本中不存在耐藥菌株，可能系標(biāo)本中存在異質(zhì)性耐藥所致[25]。因此，分子DST檢測(cè)RFP、INH、FQs耐藥時(shí)，結(jié)果可信，不建議復(fù)查。

3)若初治結(jié)核病患者第1次分子DST檢測(cè)為耐藥，而分子DST復(fù)查時(shí)結(jié)果為敏感，是判斷為敏感還是耐藥？(1)正方：首先，根據(jù)結(jié)核病耐藥流行病學(xué)資料，初治結(jié)核病耐藥率低；其次，若按耐藥結(jié)核病治療，療程長(zhǎng)，可能增加患者醫(yī)療支出及痛苦；而先按敏感菌治療，若有效只需6個(gè)月療程；若2個(gè)月后療效不佳，再改為耐藥方案，也只耽誤2個(gè)月的時(shí)間。因此，判斷為敏感。(2)反方：①分子DST檢測(cè)RFP、INH、FQs耐藥的結(jié)果是可靠的，可為快速診斷、早期治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，是分子DST最大的優(yōu)點(diǎn)；②復(fù)查標(biāo)本可能來(lái)自不同部位的病灶，或同一部位的不同MTB克隆，2次檢測(cè)結(jié)果不一致是有可能的；③2個(gè)月治療有效不代表不存在耐藥菌，殺滅了標(biāo)本中存在的敏感菌可能會(huì)導(dǎo)致患者病情暫時(shí)好轉(zhuǎn)，但剩余的耐藥菌在體內(nèi)增殖會(huì)導(dǎo)致后期病情惡化。因此，分子DST檢測(cè)RFP、INH、FQs只要出現(xiàn)1次檢測(cè)為耐藥，一般要考慮為耐藥，而對(duì)其他藥物可結(jié)合表型DST和患者臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。

4)對(duì)于涂陰的結(jié)核病患者，無(wú)需進(jìn)行分子DST檢測(cè)。(1)正方：涂陰的結(jié)核病患者荷菌量少或不排菌，病情較輕，若根據(jù)表型或分子DST結(jié)果判斷為耐藥，患者必將會(huì)因?yàn)閼?yīng)用耐藥治療方案而可能增加藥物不良反應(yīng)，療程延長(zhǎng)，增加費(fèi)用。(2)反方：通過(guò)分子DST可檢出65%～75%涂陰結(jié)核病患者標(biāo)本中的耐藥MTB[24]，如果應(yīng)用分子DST在涂陰的結(jié)核病患者標(biāo)本中檢出MTB對(duì)RFP、INH、FQs耐藥，通常結(jié)果是可信的，既提示該患者并非不排菌，而是排菌量少(通常每毫升痰少于5000條菌)[35]；也提示標(biāo)本中所含耐藥MTB的比率較高(>20%)。因此，需對(duì)涂陰的結(jié)核病患者進(jìn)行分子DST檢測(cè)，以早期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病患者，并早期開(kāi)展有效治療，以免延誤治療使病情惡化。

結(jié) 語(yǔ)

20世紀(jì)末MTB分子DST產(chǎn)品問(wèn)世，并逐步推廣應(yīng)用于臨床。但在耐藥結(jié)核病的診斷和指導(dǎo)臨床合理組合化療方案上尚未達(dá)到預(yù)期的效果，對(duì)大多數(shù)藥物耐藥性檢測(cè)的敏感度和特異度還不夠高，仍需不斷改進(jìn)并研發(fā)更多產(chǎn)品以滿足臨床需求。隨著MTB耐藥機(jī)制的進(jìn)一步闡明、生物技術(shù)的不斷發(fā)展、企業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平的不斷提高、臨床療效相關(guān)性研究的不斷深入，相信會(huì)有更多簡(jiǎn)便、快速的MTB耐藥性檢測(cè)新產(chǎn)品問(wèn)世，并在臨床上發(fā)揮其應(yīng)有的作用，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確診斷、精準(zhǔn)治療的目標(biāo)。