五苓散對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用

陳 茜，王 菁，魏 偉

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致全球視力障礙和致盲的主要原因之一[1]。我國(guó)糖尿病高發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)患病人數(shù)已超過(guò)1億，有關(guān)DR的研究也成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。DR早期病理變化是血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)結(jié)構(gòu)及功能的破壞[3]。近年來(lái)，關(guān)于中醫(yī)藥防治DR的研究已取得重要進(jìn)展，主要是通過(guò)改善血-視網(wǎng)膜屏障的通透性、視網(wǎng)膜水腫、血供等進(jìn)行綜合治療，在臨床治療中被廣泛認(rèn)可。五苓散是仲景名方，在《傷寒論》中五苓散原治蓄水證，涉及全身水液代謝問(wèn)題，對(duì)于血-視網(wǎng)膜屏障通透性的變化，治宜利水滲濕為主，兼以溫陽(yáng)化氣之法。長(zhǎng)期臨床應(yīng)用證實(shí)，五苓散對(duì)DR引起的血-視網(wǎng)膜屏障的破壞有較好的治療效果[4]。本研究通過(guò)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，觀察五苓散對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜血管滲透量的影響，初步探討五苓散對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：12周齡SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001]。主要試劑：五苓散(江蘇省中醫(yī)院)；康柏西普(朗沐)；鏈脲佐菌素(STZ)、伊文思藍(lán)(EB，美國(guó)Sigma公司)；大鼠可溶性細(xì)胞間黏附分子1 (sICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江蘇科晶生物科技有限公司)；大鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體(武漢博士德公司)。主要儀器：酶標(biāo)儀(2300，EnSpire)；微量進(jìn)樣器(5μL，上海高鴿)；血糖儀(索萊寶)；石蠟切片機(jī)(RM2135，德國(guó)Leica)；組織脫水機(jī)(ASF30，德國(guó)Leica)。本研究經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模SD雄性大鼠50只適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk后，隨機(jī)分為空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠高脂高糖飼養(yǎng)2wk后，按照體質(zhì)量腹腔注射STZ 50mg/kg，72h后尾靜脈取血，血糖≥16.7mmol/L、尿糖在+++以上者則認(rèn)為糖尿病大鼠造模成功?？瞻捉M大鼠正常飲食飼養(yǎng)2wk后行等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。造模成功后，所有大鼠均正常攝食、飲水。

1.2.2藥物處理本研究所使用的五苓散由豬苓∶澤瀉∶白術(shù)∶茯苓∶桂枝=3∶3∶3∶3∶2組成，將藥物浸泡30min后煮沸1h，取出藥物，將藥物殘?jiān)尤胨笤僦蠓?h，將兩次藥物混合后濃縮至生藥含量1g/mL的藥液。造模成功1mo后，按照大鼠正常劑量為人體的6.3倍計(jì)算，經(jīng)換算高劑量組和低劑量組大鼠分別按0.74、1.5g/kg劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌胃12wk。模型組和空白組大鼠采用等量生理鹽水灌胃。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠右眼球內(nèi)使用微量進(jìn)樣器注射康柏西普3μL[5]一次。所有處理過(guò)程均由固定科研人員完成。

1.2.3血糖和體質(zhì)量監(jiān)測(cè)分別于給藥0、2、4、6、8、10、12wk，測(cè)量每組大鼠的體質(zhì)量和空腹血糖水平。

1.2.4ELISA法檢測(cè)大鼠血清sICAM-1和CRP的含量藥物處理12wk后，大鼠眼眶取血并收集血清。參考試劑盒說(shuō)明書，將各組大鼠血清加入酶標(biāo)板上，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，洗滌，加入酶標(biāo)試劑，孵育，洗滌，每孔先后加入顯色劑A和B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min，加終止液50μL，450nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算大鼠血清sICAM-1和CRP的含量。

1.2.5EB滲漏試驗(yàn)觀察大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性藥物處理12wk后，每組隨機(jī)選取4只大鼠麻醉后尾靜脈注射EB溶液45mg/kg，循環(huán)2h后處死大鼠，顯微鏡下取出右眼球并分離出視網(wǎng)膜，4℃過(guò)夜后晾干稱重，將大鼠視網(wǎng)膜與150μL甲酰胺于70℃孵育18h。低溫離心后取上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定620nm和740nm下樣品的吸光度(OD)值，并計(jì)算差值(凈吸光度值)，用視網(wǎng)膜干重(mg)標(biāo)準(zhǔn)化EB(ng)含量。每個(gè)樣品測(cè)量3次取平均值。

1.2.6HE染色觀察視網(wǎng)膜組織藥物處理12wk后，每組隨機(jī)選取3只大鼠麻醉處死，摘取右眼眼球，用10%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟石蠟包埋，切厚度為4μm的切片。脫蠟后的視網(wǎng)膜經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法觀察視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)藥物處理12wk后，每組隨機(jī)選取3只大鼠麻醉處死，視網(wǎng)膜石蠟切片制作方法同1.2.6。石蠟切片經(jīng)PBS沖洗，3%過(guò)氧化氫37℃孵育5～10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫下蛋白封閉液封閉 5min，VEGF抗體(1∶200)4℃封閉過(guò)夜，加 HRP 標(biāo)記的廣譜二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。顯微鏡下觀察并采用 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定免疫組化視網(wǎng)膜組織累積光密度(integrated optical density，IOD)。

2結(jié)果

2.1五苓散對(duì)大鼠體質(zhì)量和血糖水平的影響藥物處理前后，各組大鼠體質(zhì)量和血糖水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(體質(zhì)量：F時(shí)間=143.953，P時(shí)間<0.001；F組間=210.282，P組間<0.001；F交互=280.769，P交互<0.001；血糖：F時(shí)間=3.583，P時(shí)間=0.007；F組間=939.474，P組間<0.001；F交互=2.783，P交互=0.003)。給藥0wk，模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、血糖水平與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明造模成功。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量變化不明顯。給藥10、12wk，高劑量組大鼠體質(zhì)量高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠血糖水平無(wú)明顯變化。給藥10、12wk，高劑量組大鼠血糖水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、2。

2.2各組大鼠血清sICAM-1和CRP的含量模型組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均明顯高于空白組，高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均顯著低于模型組，高劑量組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均低于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量組大鼠血清sICAM-1和CRP含量高于陽(yáng)性對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

圖1HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織(×400) A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽(yáng)性對(duì)照組。

組別只數(shù)給藥0wk給藥2wk給藥4wk給藥6wk給藥8wk給藥10wk給藥12wk空白組10335.43±15.15375.45±18.40406.03±18.51434.83±17.45462.30±17.29493.59±23.71531.22±21.79模型組10266.11±19.56246.29±18.72235.36±18.16236.10±16.99225.81±16.49217.30±15.83216.03±17.48高劑量組10248.79±20.34232.88±19.26227.56±23.29233.78±21.83239.81±20.97247.62±6.06a248.58±23.36a低劑量組10250.54±19.92230.61±19.28224.56±23.24227.17±22.79232.79±21.80233.48±20.23237.01±18.67陽(yáng)性對(duì)照組10246.86±17.72227.11±16.55221.14±21.59222.50±23.79222.61±21.91224.66±20.72228.51±17.48

注：aP<0.05vs模型組。

組別只數(shù)給藥0wk給藥2wk給藥4wk給藥6wk給藥8wk給藥10wk給藥12wk空白組105.76±0.415.79±0.555.71±0.465.59±0.525.17±0.565.16±0.395.54±0.33模型組1028.11±2.6128.56±1.9927.97±2.3228.10±2.0327.55±2.6128.00±2.3228.25±1.56高劑量組1029.34±2.5028.15±1.8027.54±2.1226.90±2.4425.99±1.6625.64±1.81a25.56±2.48a低劑量組1027.54±2.5226.75±1.8225.71±2.3427.67±1.6226.96±1.6327.00±1.2826.83±2.47陽(yáng)性對(duì)照組1027.66±2.2727.06±2.5126.69±1.7927.01±1.9127.20±2.3327.4±1.6027.25±2.46

注：aP<0.05vs模型組。

組別只數(shù)ICAM-1(μg/g)CRP(ng/mL)空白組104.30±0.231.61±0.40模型組1014.33±0.225.30±0.32高劑量組1011.31±1.423.71±0.40低劑量組1011.94±1.544.13±0.16陽(yáng)性對(duì)照組1011.84±1.614.05±0.24 F91.561230.78P<0.001<0.001

2.3大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的通透性空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量分別為4.21±0.43、23.68±0.43、13.71±2.78、15.77±4.15、15.18±2.23ng/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.446，P<0.001)。模型組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量明顯高于空白組，高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量均較模型組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織EB滲透量低于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組低于低劑量組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果空白組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，排列有序(圖1A)；模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層排列紊亂，呈空泡樣，內(nèi)、外核層水腫，出現(xiàn)空泡樣改變，可見(jiàn)血管樣結(jié)構(gòu)(圖1B)；低劑量組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞見(jiàn)較小空泡，各層組織見(jiàn)輕度水腫，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列較疏松、紊亂，可見(jiàn)較大空泡(圖1C)；高劑量組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)和排列較清晰，水腫減輕，較模型組明顯改善(圖1D)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂、水腫、溶解，外核層細(xì)胞間明顯水腫、排列疏松、紊亂(圖1E)。

2.5各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)情況空白組大鼠視網(wǎng)膜中有少量VEGF表達(dá)；模型組大鼠視網(wǎng)膜各層均有VEGF表達(dá)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層及色素上皮層呈深棕黃色；高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)下調(diào)，外核層可見(jiàn)(圖2)。空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF累積光密度值分別為146.2046±45.2672、1090.5060±131.2153、644.8474±36.4814、814.8597±26.5625、594.8474±27.3713，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.163，P<0.001)。高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF表達(dá)量均低于模型組，高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF表達(dá)量均低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中VEGF表達(dá)量低于高劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2免疫組織化學(xué)染色法觀察視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)(×400) A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽(yáng)性對(duì)照組。

3討論

迄今為止，對(duì)于DR的發(fā)病機(jī)制和代謝通路仍未闡明，炎癥反應(yīng)對(duì)DR的發(fā)展起到關(guān)鍵作用[6]。機(jī)體在持續(xù)高糖狀態(tài)下，糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與其受體(RAGE)結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通道，使sICAM-1表達(dá)上調(diào)[7]。白細(xì)胞黏附于視網(wǎng)膜血管壁可導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和毛細(xì)血管無(wú)灌注，故sICAM-1水平升高是DR最早的病理變化之一[8]。抑制sICAM-1的表達(dá)可以明顯降低白細(xì)胞瘀滯和BRB破壞[9]，延緩DR的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)增加，影響內(nèi)皮緊密結(jié)合蛋白的功能，促使BRB的破壞，VEGF和炎癥因子之間的相互作用在DR和糖尿病性黃斑水腫(DME)的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用[10]。CRP是重要的炎癥標(biāo)志物，是由炎性細(xì)胞因子白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF)刺激肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成的一種全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標(biāo)志物，目前關(guān)于CRP與糖尿病關(guān)系的研究越來(lái)越受到關(guān)注[11]。Nalini等[12]發(fā)現(xiàn)在DR進(jìn)展中，視網(wǎng)膜組織損傷可導(dǎo)致CRP水平升高，與糖尿病無(wú)視網(wǎng)膜病變患者比較，DR患者的炎癥因子(TNF-α、CRP)水平升高。此外，CRP可促進(jìn)糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期持久的低度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，引起微血管病變[13]。

DR屬于中醫(yī)“消渴目病”范疇，主要病因病機(jī)為氣陰虧虛、脾腎兩虛，久致痰濕內(nèi)生，脈絡(luò)瘀阻，目失濡養(yǎng)。消渴目病水濕內(nèi)停導(dǎo)致氣滯血瘀，進(jìn)而加劇DR的進(jìn)展，使患者視力下降。目前，臨床中對(duì)于DR和靜脈阻塞引起的黃斑水腫的治療一般采用激光治療、玻璃體腔注射抗VEGF藥物和糖皮質(zhì)激素治療等，均取得明顯的療效[14]。中醫(yī)認(rèn)為，黃斑屬脾，水腫屬濕和水停，故辯證為脾腎陽(yáng)虛、水濕內(nèi)停、水濕上泛證。五苓散經(jīng)驗(yàn)方中重用澤瀉為君，直達(dá)腎與膀胱，利水滲濕。臣以茯苓、豬苓增強(qiáng)其利水滲濕之力。佐以白術(shù)健脾以運(yùn)化水濕，桂枝通陽(yáng)化氣，化氣布津。王琦認(rèn)為五苓散并非專門利尿，更善于化氣布津，分消水氣，對(duì)于水蓄膀胱，水停體內(nèi)一部分，水逆等均可發(fā)揮功效[15]。研究發(fā)現(xiàn)，五苓散穴位敷貼治療脾陽(yáng)虧虛型痛風(fēng)，治療1mo后，CRP顯著低于治療前[16]。

綜上所述，五苓散經(jīng)驗(yàn)方對(duì)大鼠體質(zhì)量和血糖水平無(wú)明顯影響，雖然不能降低高血糖狀態(tài)，但是卻可以緩解體質(zhì)量病態(tài)性下降。五苓散可以下調(diào)血清中炎癥因子(sICAM-1、CRP)的表達(dá)，降低視網(wǎng)膜組織中EB的滲透量，減輕視網(wǎng)膜水腫，改善血-視網(wǎng)膜屏障功能，抑制DR進(jìn)展。但是，目前關(guān)于五苓散對(duì)DR的治療作用和機(jī)制尚處于初級(jí)階段，有待進(jìn)一步的研究。