5種免疫透射比濁法試劑盒檢測(cè)特定蛋白鉤狀效應(yīng)的性能評(píng)估

楊 杰，李 玲，張瀚允，張 鵬，曾方銀△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510900)

免疫比濁測(cè)定是臨床常用的檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)其方法原理的不同，可分為免疫散射比濁法和免疫透射比濁法；前者需要專(zhuān)用的散射免疫分析儀，而后者可在全自動(dòng)生化分析儀上自動(dòng)進(jìn)行。采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行免疫透射比濁測(cè)定，具有分析速度快、檢測(cè)成本低、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著膠乳增強(qiáng)技術(shù)的改進(jìn)、試劑盒質(zhì)量的提高、量值溯源的進(jìn)步，臨床上采用免疫透射比濁法測(cè)定血液、體液中的微量物質(zhì)越來(lái)越普遍[1-5]。但早在1935年HEIDELBERGER對(duì)沉淀素的研究時(shí)就發(fā)現(xiàn)抗原濃度與免疫復(fù)合物沉淀量之間呈非線性的關(guān)系：在恒定劑量的抗體溶液中加入不同劑量的抗原時(shí)，免疫復(fù)合物的生成量，起初隨著抗原劑量的增加而逐步增加；當(dāng)達(dá)到峰值后，生成量隨著抗原劑量的進(jìn)一步增加反而減少。1974年MILES等[6]根據(jù)劑量-效應(yīng)測(cè)試曲線的形狀，首次提出hook效應(yīng)(即鉤狀效應(yīng))這一概念。目前鉤狀效應(yīng)多指抗原過(guò)剩，準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)應(yīng)稱(chēng)為高劑量的鉤狀效應(yīng)。如果標(biāo)本中待測(cè)物濃度過(guò)高，免疫透射比濁法的結(jié)果會(huì)受到鉤狀效應(yīng)的影響而出現(xiàn)假性低值；若檢測(cè)者不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)這一問(wèn)題，則會(huì)發(fā)出錯(cuò)誤報(bào)告，嚴(yán)重影響患者診斷和治療[7-8]。不同品牌的試劑，防范鉤狀效應(yīng)的能力不盡相同，筆者選擇了市場(chǎng)占有率比較高的5種試劑盒，以臨床上易出現(xiàn)高值的6個(gè)特定蛋白項(xiàng)目為例，進(jìn)行抗原過(guò)量性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)，評(píng)估不同試劑盒應(yīng)對(duì)鉤狀效應(yīng)的性能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 準(zhǔn)備各項(xiàng)目的高濃度樣本，鏈球菌溶血素O(ASO)和尿微量清蛋白(mALB)高濃度樣本來(lái)源于人高值血清混合物；超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、β2-微球蛋白(β2-MG)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)高值標(biāo)本由人體液提取純化的各自蛋白純品組成；血清胱抑素C(CysC)高值標(biāo)本是重組人胱抑素C蛋白。以上6個(gè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)樣本最高濃度至少不低于前期收集的臨床樣本最高可見(jiàn)濃度(數(shù)據(jù)未展示)。

1.2儀器與試劑 深圳邁瑞SAL 8000生化免疫一體機(jī)。北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司、四川邁克生物科技股份有限公司、深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、寧波美康生物科技股份有限公司和北京利德曼生化股份有限公司(依次以A、B、C、D、E表示)各自生產(chǎn)的ASO、hs-CRP、β2-MG、CysC、RBP、mALB免疫透射比濁法試劑盒，并提供對(duì)應(yīng)配套的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品(四川邁克生物科技股份有限公司目前無(wú)RBP試劑盒)。

1.3方法

1.3.1不同濃度梯度的樣品制備 將上述各項(xiàng)目的高值樣本用生理鹽水進(jìn)行不同比例的稀釋(mALB高值樣本用尿液稀釋)，每個(gè)項(xiàng)目形成不同數(shù)量濃度梯度的樣品，如ASO和β2-MG各有30和27個(gè)濃度梯度，理論樣品濃度范圍分別為50～10 000 IU/mL 和1.1～226.3 mg/L。

1.3.2樣品測(cè)試 在SAL 8000生化免疫一體機(jī)的BS-2000生化模塊上按各廠家試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定各項(xiàng)目的檢測(cè)參數(shù)，再用各自配套的校準(zhǔn)品對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)高低2個(gè)濃度水平的質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，確保室內(nèi)質(zhì)控在控的情況下測(cè)試每個(gè)項(xiàng)目不同濃度梯度的樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)2次。

1.4數(shù)據(jù)處理 以每個(gè)樣品2次檢測(cè)結(jié)果均值為縱坐標(biāo)，理論濃度為橫坐標(biāo)，繪制劑量-效應(yīng)曲線，確定其后帶限(劑量-效應(yīng)曲線右側(cè)與分析測(cè)量范圍上限吸光度信號(hào)相等的濃度點(diǎn))，即抗原過(guò)量時(shí)檢測(cè)的安全范圍(分析測(cè)量范圍上限至后帶限之間的濃度范圍)上限。

2 結(jié) 果

2.15種試劑盒不同項(xiàng)目的劑量-效應(yīng)曲線 樣品實(shí)測(cè)濃度起初隨著配制濃度的升高而升高，在到達(dá)平衡點(diǎn)濃度之后實(shí)測(cè)值隨樣品濃度升高反而減少(圖1～6)。如圖1中A、B、C、D、E 5種試劑測(cè)定ASO時(shí)，其抗原-抗體結(jié)合達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí)的ASO濃度分別為1 150、4 000、5 000、3 000、2 000 IU/mL左右，超過(guò)以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢(shì)。

2.25種試劑盒抗原過(guò)量安全范圍上限 劑量-效應(yīng)曲線的濃度變化和生產(chǎn)廠家宣稱(chēng)的分析測(cè)量范圍上限進(jìn)行比較，估計(jì)出抗原過(guò)量安全范圍上限，見(jiàn)表1。其中B、C、D 3種試劑盒測(cè)定ASO的安全范圍上限最大，可達(dá)到10 000 IU/mL 以上，A和E則分別在理論濃度為1 150 IU/mL 和4 000 IU/mL左右會(huì)發(fā)生鉤狀效應(yīng)；B、C試劑測(cè)定hs-CRP的安全范圍上限超過(guò)1 000 mg/L，A、E分別為750 mg/L 和340 mg/L 左右，而D試劑盒宣稱(chēng)的hs-CRP分析測(cè)量范圍上限為15 mg/L，測(cè)試無(wú)意義；B、C試劑盒測(cè)定β2-MG時(shí)，在226 mg/L 左右仍未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，A和E的安全范圍上限分別為204 mg/L 和147 mg/L 左右，D顯示的安全范圍上限最小，僅為18 mg/L 左右；CysC檢測(cè)結(jié)果表明，C和E試劑的安全范圍上限最大，可達(dá)到112 mg/L 以上，其次是A和B，均在11 mg/L 左右出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，最小的是D，僅在9 mg/L 左右即出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)；A、C、E 3種試劑盒檢測(cè)RBP時(shí)的安全范圍上限均在700 mg/L 以上，D在550 mg/L 左右；對(duì)于mALB的測(cè)定，A和B安全范圍上限較低，分別在6 534 mg/L 和2 178 mg/L 左右，C試劑盒在理論濃度21 780 mg/L 左右會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，而D試劑安全范圍上限可高達(dá)43 560 mg/L 以上(配制的mALB樣品從第3個(gè)濃度開(kāi)始反應(yīng)度超過(guò)D試劑盒最高濃度校準(zhǔn)品反應(yīng)度，結(jié)果用反應(yīng)度和校準(zhǔn)規(guī)則計(jì)算)，E試劑盒在檢測(cè)高濃度mALB樣本時(shí)出現(xiàn)干擾，結(jié)果不準(zhǔn)確，不予分析。

圖1 ASO劑量-效應(yīng)曲線

圖2 hs-CRP劑量-效應(yīng)曲線

圖3 β2-MG劑量-效應(yīng)曲線

圖4 CysC劑量-效應(yīng)曲線

圖5 RBP劑量-效應(yīng)曲線

圖6 mALB劑量-效應(yīng)曲線

項(xiàng)目AmhookBmhookCmhookDmhookEmhookASO(IU/mL)1 2001 1501 000>10 0001 000>10 000800>10 0004004 000hs-CRP(mg/L)320750320>1 000320>1 00015-160340β2-MG(mg/L)5020480>22618>226181820147CysC(mg/L)8117.8118>112898>112RBP(mg/L)250>700--150>700126550100>700mALB(mg/L)2006 5344002 17830021 780300>43 5601 000-

注：m表示試劑宣稱(chēng)的分析測(cè)量范圍上限；hook表示抗原過(guò)量安全范圍上限；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

臨床上經(jīng)常測(cè)定的多種血漿蛋白類(lèi)物質(zhì)如CysC、mALB、ASO、RBP、hs-CRP等病理濃度分布范圍寬廣，在疾病重癥狀態(tài)下其濃度顯著升高，可達(dá)到異常高值甚至超過(guò)正常參考區(qū)間上限的百倍以上。其臨床可見(jiàn)的濃度越高，超過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)分析測(cè)量范圍上限而出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)越大。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的鉤狀效應(yīng)，防止報(bào)告偏低甚至錯(cuò)誤的測(cè)定結(jié)果仍是臨床需要高度重視的問(wèn)題。

本研究以5種免疫透射比濁法試劑盒檢測(cè)6種特定蛋白項(xiàng)目為例，進(jìn)行了鉤狀效應(yīng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同廠家試劑能達(dá)到的抗原過(guò)量安全范圍有很大差異，如B、C、D,3種試劑盒測(cè)定ASO時(shí)，抗原過(guò)量安全范圍上限均大于10 000 IU/mL，而A僅為1 150 IU/mL左右，B試劑盒測(cè)定β2-MG的安全范圍上限在226 mg/L 以上，而D僅為18 mg/L 左右，結(jié)果較易受到鉤狀效應(yīng)的影響。抗原過(guò)量的安全范圍主要與試劑的質(zhì)量有關(guān)，試劑盒的配方至關(guān)重要，包括抗體質(zhì)量(純度、效價(jià))、抗體濃度、緩沖體系、聚乙二醇(PEG)的分子大小和濃度選擇、膠乳交聯(lián)技術(shù)等多個(gè)方面[9-10]。配方好的試劑盒若其分析測(cè)量范圍足夠?qū)挘梢愿采w所有臨床可見(jiàn)的樣本濃度，就不會(huì)存在鉤狀效應(yīng)。研究表明，IgM試劑盒中抗體濃度越高，所能準(zhǔn)確檢測(cè)到的抗原濃度越高，安全報(bào)告范圍也越寬，鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)得越少[11]。在其他條件已然優(yōu)化的情況下，要拓寬分析測(cè)量范圍的關(guān)鍵是添加足夠多的抗體，但這勢(shì)必會(huì)大幅度提高試劑的成本，醫(yī)療機(jī)構(gòu)和患者需要隨之付出更大的成本。因此，試劑盒的設(shè)計(jì)需要在成本和臨床性能之間達(dá)成一個(gè)平衡，才能以經(jīng)濟(jì)有效的方法保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

試劑盒的配方優(yōu)化是防范鉤狀效應(yīng)的一個(gè)有效手段，但并非萬(wàn)能。要防止因鉤狀效應(yīng)的出現(xiàn)而發(fā)出錯(cuò)誤報(bào)告，還需要結(jié)合分析儀器的測(cè)量程序。不同品牌的全自動(dòng)生化分析儀，其加樣、加試劑的步驟和時(shí)間、吸光度的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)等差異較大，需要結(jié)合生化分析儀的具體性能，綜合應(yīng)用多種方法，如反應(yīng)曲線特征識(shí)別和報(bào)警、樣品預(yù)稀釋、抗原或抗體二次添加等[12-16]。而反應(yīng)曲線特征識(shí)別和報(bào)警，不同廠家的報(bào)警參數(shù)算法也可能不同，對(duì)于采用開(kāi)放系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，需要向廠家工程技術(shù)人員詳細(xì)了解其算法，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果合理設(shè)置報(bào)警參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證，才能在出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)時(shí)及時(shí)給出有效提示。

一些廠家的免疫比濁試劑盒說(shuō)明書(shū)上會(huì)宣稱(chēng)抗原過(guò)量的安全范圍，如羅氏診斷和西門(mén)子醫(yī)療ASO試劑說(shuō)明書(shū)宣稱(chēng)其分別在4 000 IU/mL 和8 500 IU/mL 時(shí)未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，而很多廠家僅聲明了分析測(cè)量范圍的上限，未對(duì)鉤狀效應(yīng)的限值作出說(shuō)明。因此，實(shí)驗(yàn)室在采購(gòu)試劑的時(shí)候，應(yīng)該關(guān)注廠家的性能宣稱(chēng)，重視試劑的質(zhì)量。臨床使用前，應(yīng)該根據(jù)項(xiàng)目的病理生理濃度分布寬度進(jìn)行鉤狀效應(yīng)性能的驗(yàn)證，驗(yàn)證試劑盒抗原過(guò)剩區(qū)是否與蛋白的病理生理濃度兼容，選擇防范鉤狀效應(yīng)性能最好的試劑盒，防止發(fā)出錯(cuò)誤報(bào)告，減少標(biāo)本的復(fù)測(cè)，降低檢測(cè)成本并提高工作效率。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同廠家免疫透射比濁法試劑盒檢測(cè)特定蛋白時(shí)抗原過(guò)量安全范圍有較大的差異，實(shí)驗(yàn)室在選擇試劑盒時(shí)對(duì)其防范鉤狀效應(yīng)性能進(jìn)行驗(yàn)證很有必要；若結(jié)合測(cè)量程序的報(bào)警參數(shù)優(yōu)化，可有效降低發(fā)出錯(cuò)誤報(bào)告的風(fēng)險(xiǎn)。