高原地區(qū)血細胞VHL基因變化與紅細胞增多癥的相關(guān)性分析

馬曉燕，劉淑敏

(青海紅十字醫(yī)院檢驗科，青海西寧 810000)

紅細胞增多癥的發(fā)生、發(fā)展具有顯著的個體差異及種族差異，有研究表明，高原低氧導致促紅細胞生成素(EPO)水平上升，從而引起骨髓造血能力升高，是疾病發(fā)生的重要因素[1]。EPO受各方面因素的影響，在供氧不足的情況下會造成缺氧誘導因子-1(HIF-1)水平升高，HIF-1能結(jié)合缺氧反應(yīng)元件，從而刺激EPO的表達，最終誘發(fā)紅細胞增多癥。VHL基因指導合成的VHL蛋白能借助于泛素化從而控制HIF-1水平，所以，在紅細胞增多癥患者的發(fā)病過程中具有重要影響。同時，最新研究表明，部分疾病易感性與VHL基因拷貝數(shù)存在重要的聯(lián)系[2]。本研究主要分析了高原紅細胞增多癥患者VHL基因拷貝數(shù)的變化情況及二者的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2017年5月本院收治的紅細胞增多癥患者30例作為研究組，其中男19例，女11例；年齡26～59歲，平均(48.19±2.21)歲；所有患者均世居高原，海拔為4 500 m。納入標準：(1)男性患者血紅蛋白(Hb)超過180 g/L，女性患者Hb超過160 g/L，合并發(fā)紺、呼吸困難、頭暈和毛細血管充血等；(2)高原地區(qū)持續(xù)居住時間超過10年。排除標準：(1)其他疾病導致的紅細胞增多；(2)合并嚴重肝、腎功能障礙；(3)妊娠哺乳期女性。選取同期健康體檢人員30例作為對照組，其中男16例，女14例；年齡22～58歲，平均(42.34±1.85)歲，在海拔超過4 000 m的高原持續(xù)生活超過1年。兩組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有可比性。兩組研究對象均對本研究知情同意。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2檢測方法 采集兩組研究對象空腹靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝后，-30 ℃條件下保存檢測。DNA提取應(yīng)用全血基因組試劑盒(美國，OMEGA)，提取研究對象血液樣本中的總DNA，應(yīng)用分光光度儀(美國，Nanodrop)定量檢測DNA。β-actin作為本研究的看家基因，實時熒光定量PCR標準品為本實驗室保存的人β-actin質(zhì)粒。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為SYRB(含dNTP、Mg2+、Taq酶、PCR buffer等)12．5 μL，滅菌水10．5 μL，模板DNA 1 μL，10 pmol/L的上、下游引物共 1 μL。PCR擴增條件：95 ℃條件下持續(xù)加熱10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s讀板，40個循環(huán)。溫度從50 ℃上升到95 ℃，每上升0.2 ℃讀板1 s，分析熔解曲線，計算VHL基因及β-actin的比值，從而得到VHL基因拷貝數(shù)。

1.3觀察指標 對比兩組研究對象VHL基因拷貝數(shù)、一般資料及外周血常規(guī)指標，分析基因拷貝數(shù)變化與紅細胞增多癥的相關(guān)性[3]。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，對計量資料進行正態(tài)檢驗，再分別描述正態(tài)分布資料、非正態(tài)分布資料組間比較應(yīng)采用的統(tǒng)計學方法，結(jié)果部分先描述計量資料正態(tài)檢驗結(jié)果(提供相應(yīng)的參考值)，證實是正態(tài)或非正態(tài)分布后再采用正確的方法進行后續(xù)的組間比較。采用logistic回歸模型進行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對象VHL基因拷貝數(shù)和一般資料比較 研究組VHL基因拷貝數(shù)顯著低于對照組，研究組年齡、EPO均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組研究對象性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象VHL基因拷貝數(shù)和一般資料比較

2.2兩組研究對象外周血常規(guī)指標比較 研究組白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、Hb和血細胞比容(Hct)均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象外周血常規(guī)指標比較±s)

2.3紅細胞增多癥與臨床因子的相關(guān)性 研究組VHL基因拷貝數(shù)、EPO、RBC和Hb與紅細胞增多癥呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 紅細胞增多癥與臨床因子的相關(guān)性

2.4紅細胞增多癥風險因素的logistic回歸模型分析 VHL基因拷貝數(shù)和EPO是紅細胞增多癥的重要風險因素(P<0.05)。見表4。

表4 紅細胞增多癥風險因素的logistic回歸模型分析

3 討 論

紅細胞增多癥是人類生活在高原低壓缺氧環(huán)境時紅細胞出現(xiàn)代償性過度增生的問題，從而使血液黏滯度顯著上升，并引起血流阻力的升高，進而導致患者出現(xiàn)一系列癥狀、體征的臨床綜合征[4]。

高原紅細胞增多癥可以說是臨床較常見的一種慢性高原病。隨著海拔的上升(尤其是海拔高度超過3 000 m后)，臨床發(fā)病率呈顯著上升的趨勢，這是因為人體長期生活在高原慢性缺氧條件下，會出現(xiàn)一系列相應(yīng)變化，如RBC、Hb和Hct水平顯著上升[5]。這是人體對高海拔缺氧狀態(tài)的代償保護機制。不過人體的自適應(yīng)保護機制突破自身耐受程度時就會出現(xiàn)高原病，也就是高原適應(yīng)衰退，從而給心臟、肺、肝、脾等器官帶來一定程度的不良影響。

紅細胞增多癥的病理作用機制十分復(fù)雜，簡言之就是高原居民機體中的動脈血氧分壓水平和動脈血氧飽和度水平下降，動脈二氧化碳分壓水平上升，導致細胞內(nèi)部出現(xiàn)超微病理改變，進一步刺激炎癥細胞因子、低氧誘導因子和EPO的表達，使造血干細胞持續(xù)分化，血液中Hb、RBC和Hct水平上升，通過這一途徑來滿足人體器官耗氧，適應(yīng)低壓、低氧的惡劣環(huán)境[6]。如果低氧環(huán)境長期無法得到有效改善，就會影響人體內(nèi)部的代償平衡，導致器官、組織發(fā)生生理病理變化，進一步損傷人體器官、組織。因此，分析紅細胞增多癥的發(fā)病機制是預(yù)防、治療紅細胞增多癥的主要途徑，尋找該病的標志因子則是早期診斷的關(guān)鍵技術(shù)[7]。尤其是隨著近年來我國高原地區(qū)的持續(xù)深入開發(fā)及移居高原居民數(shù)量的上升，慢性高原病特別是紅細胞增多癥的預(yù)防及治療成為高原地區(qū)衛(wèi)生服務(wù)的主要內(nèi)容之一。

人類VHL基因位于染色體3p25，包括2個內(nèi)含子及3個外顯子，編碼長度為5 kb，參與構(gòu)成多種復(fù)合蛋白體，同時，可調(diào)節(jié)人體中低氧誘導表達[8]。本研究結(jié)果顯示，紅細胞增多癥患者VHL基因拷貝數(shù)顯著低于健康個體，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示該病患者VHL基因合成蛋白質(zhì)水平下降，進一步影響HIF-1α的降解功能，使HIF-1α水平持續(xù)上升。HIF-1α水平持續(xù)升高會影響到EPO表達，增加EPO的生成及分泌。在這一背景下，人體中的紅細胞就會出現(xiàn)繼續(xù)增殖的問題。因此，紅細胞增多癥是EPO基因影響低氧誘導區(qū)的位點，從而誘發(fā)T-G突變及T/G雜合等錯序排列，同時，低氧誘導區(qū)的GG區(qū)與TT區(qū)比較，表達頻率上升[9]。提示紅細胞增多癥患者的易感基因位點往往合并基因突變，同時，也為分子遺傳層面分析該病提供了新的思路。此外，有研究分析了高原肺水腫患者，結(jié)果顯示，這些患者普遍存在HLA-DR6及DQ4基因易感性，提示移居高原的紅細胞增多癥患者同樣存在HLA-DR6、DQ4的易感性[10]。

隨著基因組工程的進展，有研究表明，高原健康個體之所以可以適應(yīng)極端氣候，主要是受VEGFA基因、AKT3基因和NOS3基因影響的VEGF信號通路及血管生長因子協(xié)同發(fā)揮作用的結(jié)果。有研究還發(fā)現(xiàn)了可適應(yīng)極端氣候基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，如紅細胞的位點rs4590656、Hb位點rs100731和藏族居民紅細胞增多癥患者的紅細胞的位點rs1570360[11]。有研究在紅細胞增多癥易感基因的SNP位點檢測過程中發(fā)現(xiàn)，移居的漢族居民及世居的藏族居民在發(fā)病率方面存在一定的區(qū)別，ANGPTL4SNP的遺傳距離為0.061，VEGFASNP的遺傳距離為0.043 8，NOS3T基因的遺傳距離為0.08[12]。這是長期居住高原人群紅細胞增多癥發(fā)病的易感性標示之一。

VHL基因能借助于泛素化調(diào)控HIF-1α表達水平，從而間接影響各種因子的轉(zhuǎn)錄功能。這一途徑也就是“VHL/HIF通路”。紅細胞增多癥患者中，因為VHL基因拷貝數(shù)下降，根據(jù)中心法則計算會使患者VHL基因中的蛋白質(zhì)水平下降，從而影響到對HIF-1α的降解。這樣一來，患者HIF-1α水平就會持續(xù)上升。HIF-1α水平的持續(xù)上升會導致EPO表達的上升，從而導致紅細胞增多癥的發(fā)生、發(fā)展[13]。

本研究結(jié)果顯示，研究組WBC、RBC、Hb和Hct等均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時，研究組VHL基因拷貝數(shù)、EPO、RBC和Hb與紅細胞增多癥呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。這是因為長期生活在高海拔地區(qū)者經(jīng)數(shù)千年的自然選擇后，形成了獨特同時復(fù)雜的低氧耐受機制，使其Hb水平不會因為低氧而持續(xù)上升，甚至低于平原地區(qū)漢族人群的平均Hb水平。有研究表明，長期居住在我國西藏和青海地區(qū)的藏族居民Hb水平略低于移居的漢族居民，但女性Hb水平略高于移居的漢族居民，不同性別的居民在Hb水平方面存在顯著差異。同時，有研究表明，與居住在海拔高度類似的安第斯山居民比較，藏族居民平均Hb水平要低10%左右[14]。

藏族居民獨特的適應(yīng)能力推測與其基因存在聯(lián)系。缺氧可顯著提高細胞中EPAS1蛋白質(zhì)水平，從而強化糖酵解酶及EPO的表達，維持人體內(nèi)部的氧平衡及Hb水平穩(wěn)定。高原地區(qū)居民VHL基因表達的上調(diào)與Hb水平的下降存在著不容忽視的重要聯(lián)系。

VHL基因變化已成為診斷紅細胞增多癥的重要分子學標準。紅細胞增多癥患者中，VHL基因下降的陽性率超過90%。這是因為VHL基因拷貝數(shù)下降會激活JAK2-STAT途徑，使紅細胞過度增殖。不過高原地區(qū)紅細胞增多癥患者VHL基因變化狀況及發(fā)生頻率高低方面的研究較少。有研究表明，紅細胞增多癥患者往往合并心、腦器官嚴重損害，主要是心、腦血管異常及栓塞，同時，部分患者合并肝、腎功能及胃腸功能障礙。表明在紅細胞增多癥惡化的過程中，容易導致患者內(nèi)臟器官受損，給患者造成致命性病理學損傷。因此，需引起醫(yī)務(wù)人員對紅細胞增多癥的高度重視，從而及時診治，防止紅細胞增多癥患者出現(xiàn)并發(fā)癥[15]。

本研究進行的紅細胞增多癥臨床因素的logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，VHL基因拷貝數(shù)和EPO是紅細胞增多癥的重要危險因素(P<0.05)，提示基因領(lǐng)域的相關(guān)研究對分析紅細胞增多癥的病因具有不容忽視的重要價值。不過需注意的是，截至目前，研究人員的相關(guān)數(shù)據(jù)對探索不同低壓、低氧環(huán)境條件下人體的基因變化尚無嚴格規(guī)范的標準，推測是因為能影響基因改變的因素較少。此外，基因與基因之間的作用及基因與環(huán)境之間的作用也需要納入高海拔疾病基因研究中。因此，在后續(xù)的研究過程中應(yīng)該應(yīng)用多態(tài)性基因數(shù)據(jù)及單體型圖，從而改善潛在易感位點的檢測質(zhì)量。與此同時，已有的基因領(lǐng)域研究結(jié)果存在的可變性，提示受種群遺傳背景等方面的影響，人體的基因表達水平也存在一定程度的不同。紅細胞增多癥患者可能存在其他的潛在影響因素。因此，綜合應(yīng)用多種方法進行研究，有利于確定在不同高海拔地區(qū)種群缺氧耐受情況的遺傳基礎(chǔ)，從而幫助人們更加有效地預(yù)防紅細胞增多癥的發(fā)生。

綜上所述，高原地區(qū)紅細胞增多癥患者普遍存在VHL基因拷貝數(shù)下降的問題，這與病情的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。