陜西菜田2種粉虱數(shù)量結(jié)構(gòu)及煙粉虱生物型鑒定

劉 晨，張偉兵，洪 波，張 鋒，張淑蓮，李英梅

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043；2.陜西省蠶桑園藝技術(shù)工作站，西安 710003)

溫室白粉虱(TrialeurodesvaporariorumGennadius)與煙粉虱(BemisiatabaciGennadius)同屬半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidaw)小粉虱屬，2種粉虱形態(tài)相似，?；旌习l(fā)生[1]，為害多種蔬菜及園林花卉[2]。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，設(shè)施農(nóng)業(yè)面積增加，設(shè)施生態(tài)環(huán)境優(yōu)越，有利于煙粉虱和溫室白粉虱的越冬及其增殖，其發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為北方地區(qū)蔬菜、花卉、林果等生產(chǎn)中的重要害蟲，可危害多種寄主植物，還可傳播多種植物病毒[3-4]，暴發(fā)時(shí)給世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失[5]。煙粉虱作為一個(gè)快速進(jìn)化的物種復(fù)合體[6]，其遺傳特性極復(fù)雜，可分為多個(gè)不同的生物型，目前已知至少26個(gè)生物型[7]，其中B型和Q型是2種入侵性較強(qiáng)的生物型[8]，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟列入全球100種最危險(xiǎn)入侵生物[9]。劉樹生[6]對(duì)B型煙粉虱對(duì)土著煙粉虱的交配行為互作、入侵和取代土著煙粉虱的重要機(jī)制進(jìn)行研究，B型煙粉虱可通過干擾土著煙粉虱的交配行為達(dá)到抑制取代土著煙粉虱種群。另有研究表明，Q型煙粉虱耐藥性高于B型，這種耐藥性機(jī)制主要與Q型煙粉虱具有的抗性可遺傳性及P450基因過表達(dá)導(dǎo)致的解毒作用增強(qiáng)有關(guān)[10-11]。在這種耐藥性的選擇下，Q型煙粉虱有逐步替代B型煙粉虱的趨勢(shì)[12]。不同種類粉虱及煙粉虱不同生物型具有一定的地理分布區(qū)域。而對(duì)于陜西菜田的煙粉虱生物型、煙粉虱與白粉虱的數(shù)量結(jié)構(gòu)報(bào)道較少，本研究旨在明確陜西菜田煙粉虱和溫室白粉虱比例組成及煙粉虱生物型的變化趨勢(shì)、分布區(qū)域，為進(jìn)一步探究煙粉虱的演替規(guī)律及早期預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及制定防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 粉虱種群數(shù)量調(diào)查

1.1.1 陜西不同地區(qū)粉虱 于2014-2016年每年3月、5月、8月、11月的中旬在陜西渭南、咸陽、商洛、延安、榆林、漢中、安康等不同設(shè)施蔬菜種植區(qū)定點(diǎn)調(diào)查10個(gè)日光溫室，日光溫室均為8 m×70 m 的標(biāo)準(zhǔn)棚，每個(gè)棚室按 “Z” 型5點(diǎn)取樣法取樣，每樣點(diǎn)依次選擇20株黃瓜，每株取上、中、下3張葉片統(tǒng)計(jì)煙粉虱及白粉虱的數(shù)量。

1.1.2 不同種類蔬菜上粉虱 在陜西省大荔縣設(shè)施蔬菜生產(chǎn)區(qū)，調(diào)查黃瓜、番茄、茄子、秋葵、西葫蘆、辣椒、菜豆、南瓜、芹菜、苦瓜等10種蔬菜上煙粉虱和溫室白粉虱的蟲口數(shù)量，調(diào)查時(shí)間、方法同上。

1.1.3 不同種植模式的粉虱 在陜西省大荔縣設(shè)施蔬菜種植核心區(qū)“大荔現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)”，分別選露地、冷棚、日光溫室各10個(gè)棚室(田塊)調(diào)查黃瓜上粉虱數(shù)量，調(diào)查時(shí)間為5-9月，每隔10 d 調(diào)查1次、日光溫室與冷棚調(diào)查方法同上。露地調(diào)查方法為5點(diǎn)取樣法，田間取5個(gè)點(diǎn)，取樣點(diǎn)間距為10 m，每個(gè)點(diǎn)20株，共100株，每株取上、中、下3張葉片統(tǒng)計(jì)煙粉虱及白粉虱的數(shù)量。

1.2 生物型鑒定

1.2.1 供試蟲源 試驗(yàn)所用蟲源為2016年從陜西閻良區(qū)、三原縣、楊凌區(qū)、岐山縣、鳳翔縣、大荔縣、富平縣、商州區(qū)、鄠邑區(qū)、寶塔區(qū)、安塞縣、石泉縣、漢濱區(qū)等13個(gè)縣(區(qū))采集的煙粉虱成蟲，將采集到的成蟲浸泡于無水乙醇中，-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 煙粉虱DNA的提取 提取方法按照康為世紀(jì)動(dòng)物組織DNA提取試劑盒方法進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用引物見表1。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存，備用。

表1 煙粉虱鑒定所用引物Table 1 Primers used for biotype identification of Bemisia tabaci

1.2.4 電泳檢測(cè) 用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為80 V，電泳結(jié)束后用Gelred染色，通過凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 測(cè)序及序列比對(duì) 將PCR產(chǎn)物送至蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序[雙脫氧核酸終止法(Sanger 測(cè)序)，ABI 3730xl]。測(cè)序結(jié)果利用BLAST與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較。下載世界不同地區(qū)煙粉虱種群基因序列，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 陜西不同地區(qū)及季節(jié)粉虱種群比例組成

調(diào)查結(jié)果顯示，陜西關(guān)中、陜南、陜北不同地區(qū)設(shè)施栽培黃瓜上均有煙粉虱和溫室白粉虱的分布(表2)。從表2可以看出，不同地區(qū)種群組成比例不同，不同季節(jié)種群組成比例也不相同，但均以煙粉虱為優(yōu)勢(shì)種，占種群數(shù)的60.2%～100%。3-5月，各地均有溫室白粉虱的分布，隨著溫度的升高，在8月的時(shí)候，大荔、鄠邑、丹鳳、石泉白粉虱數(shù)量降為0，而到了11月份，由于溫度的降低，白粉虱數(shù)量又趨于回升。就不同地區(qū)而言，臨渭、大荔、涇陽、安塞、石泉、丹鳳、鄠邑等縣(區(qū))煙粉虱種群所占比例較高，占種群75.2%～100%。洋縣、洛南、榆陽等縣(區(qū))煙粉虱所占比例相對(duì)較低，占種群的55.5%～80.6%。隨著時(shí)間的推移，煙粉虱所占比例不斷提高，早春4月以前，煙粉虱所占比例相對(duì)較低，5月份以后煙粉虱所占比例較高，8月份左右所占比例最高。由于煙粉虱在陜西境內(nèi)自然條件下不能越冬，其分布與設(shè)施農(nóng)業(yè)種植分布密切相關(guān)，也呈斑塊狀不規(guī)則分布。

2.2 不同蔬菜作物粉虱數(shù)量比例組成

調(diào)查結(jié)果表明，在同一環(huán)境條件下，煙粉虱和溫室白粉虱分布特點(diǎn)不同，煙粉虱在調(diào)查的10種蔬菜上均有分布，但在不同蔬菜作物上分布數(shù)量顯著不同，其種群數(shù)量大小依次為茄子>黃瓜>番茄>秋葵>西葫蘆>南瓜>辣椒>菜豆>芹菜>苦瓜，溫室白粉虱在調(diào)查的10種蔬菜上僅在黃瓜、番茄、辣椒、菜豆、南瓜上有分布，其種群數(shù)量大小依次為番茄>黃瓜>辣椒>南瓜>菜豆。在共同為害的5種寄主中，番茄上煙粉虱與白粉虱的數(shù)量比例為83.3∶16.7，黃瓜上的數(shù)量比例為87.6∶12.4，辣椒上的數(shù)量比例為71.6∶28.4，菜豆上的數(shù)量比例為81.0∶19.0，南瓜上的數(shù)量比例為77.6∶22.4，白粉虱種群數(shù)量明顯低于同一寄主上煙粉虱的數(shù)量(表3)。

2.3 不同種植模式粉虱種群比例組成

不同種植模式黃瓜上煙粉虱和溫室白粉虱的數(shù)量比例隨時(shí)間變化而不同(圖1)，5-9月均有兩種粉虱的為害，但均以煙粉虱占優(yōu)勢(shì)種群。煙粉虱的種群數(shù)量以溫室中為最大，其次是冷棚和露地，且隨著時(shí)間推移煙粉虱種群所占比例依次提高，7月達(dá)到最高，進(jìn)入9月煙粉虱所占比例又趨于降低。白粉虱的種群數(shù)量以露地為最大、其次是冷棚和溫室，且隨著時(shí)間的推移白粉虱種群數(shù)量不斷下降，8月降到最低值，進(jìn)入9月白粉 虱種群數(shù)量又小幅回升。說明煙粉虱較白粉虱更能適應(yīng)7-8月的高溫環(huán)境，白粉虱對(duì)5月及9月的低溫環(huán)境較為適應(yīng)，2種粉虱的種群數(shù)量構(gòu)成以煙粉虱為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群。

表2 陜西不同地區(qū)粉虱種群組成比例Table 2 The population composition of gennadius sampled from differently areas in Shaanxi province %

注：數(shù)據(jù)系3 a調(diào)查的平均數(shù)。

Note: Data were represented as everage of 3 years.

表3 煙粉虱和溫室白粉虱在不同蔬菜寄主上的種群比例組成(渭南大荔)Table 3 The population proportion of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum Gennadius involved in vegetables damage in Dali, Weinan

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Lowercase letters indicated significant difference (P<0.05).

2.4 煙粉虱生物型的鑒定

采用mtDNA-CO1分子標(biāo)記技術(shù)鑒定陜西的閻良區(qū)、三原縣、楊凌區(qū)、岐山縣、鳳翔縣、大荔縣、富平縣、商州區(qū)、鄠邑區(qū)、寶塔區(qū)、安塞縣、石泉縣、漢濱區(qū)共13縣(區(qū))的煙粉虱成蟲，所測(cè)樣品均得到1條約303 bp的片段(圖2)。mtDNA-CO1標(biāo)記分子鑒定結(jié)果表明，陜西13個(gè)不同地區(qū)的煙粉虱均為Q生物型。

2.5 序列比對(duì)

將關(guān)中地區(qū)大荔縣、陜北地區(qū)寶塔區(qū)及陜南地區(qū)石泉縣的煙粉虱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，樣品與GenBank登錄號(hào)為HQ198759(美國CLM52Q型煙粉虱)、FN557454(意大利CamPo2Q型煙粉虱)等序列同源性高達(dá)99.8%(圖3)，檢測(cè)結(jié)果說明在陜西發(fā)生為害的煙粉虱均為Q生物型。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)陜西13個(gè)不同地區(qū)采集的煙粉虱樣本采 用mtDNA-CO1分子標(biāo)記技術(shù)鑒定其生物型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。所檢測(cè)的這13個(gè)煙粉虱種群mtDNA-CO1基因序列是相同的，簡(jiǎn)稱為Q-SHX。下載國外不同地區(qū)代表性煙粉虱序列(表4)進(jìn)行聚類分析，以溫室白粉虱為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從圖4可以看出，所檢測(cè)到的Q-SHX種群煙粉虱與溫室白粉虱的遺傳距離較大，首先將兩者區(qū)分。Q-SHX種群序列與B型煙粉虱的遺傳距離也較大，可以明顯區(qū)分開。從圖中還可以看出，Q-SHX種群與已知的Q型煙粉虱聚為同一進(jìn)化分支，由此可以確定，從陜西采集的煙粉虱種群為Q型煙粉虱。

圖1 不同種植模式下煙粉虱與白粉虱種群數(shù)量Fig.1 The population composition of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum Gennadius in different planting patterns

M.Marker;1～13分別為閻良區(qū)、三原縣、楊凌區(qū)、岐山縣、鳳翔縣、大荔縣、富平縣、商州區(qū)、鄠邑區(qū)、寶塔區(qū)、安塞縣、石泉縣和漢濱區(qū) 1-13 samples collected from Yanliang district, Sanyuan county, Yangling district, Qishan county, Fengxiang county, Dali county, Fuping county, Shangzhou district, Huyi district, Baota district, Ansai county, Shiquan county and Hanbin district, respectively

圖3 擴(kuò)增片段與CLM52Q和CamPo2Q生物型中 mtDNA-CO1基因的序列比對(duì)Fig.3 The alignment between the PCR products and gene sequence of mtDNA-CO1 from CLM52Q and CamPo2Q

表4 系統(tǒng)進(jìn)化分析中引用的其他序列信息Table 4 Other host information in the phylogenetic analysis

圖4 基于 mtDNA-CO1基因序列構(gòu)建的煙粉虱種群系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic relationships among the B.tabaci biotype based on the sequence of mtDNA-CO1 gene

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果顯示，在陜西地區(qū)同時(shí)存在煙粉虱和溫室白粉虱，不同地區(qū)、不同作物、不同種植模式數(shù)量結(jié)構(gòu)差異顯著，但均以煙粉虱為優(yōu)勢(shì)種，煙粉虱生物型鑒定結(jié)果顯示陜西為Q型煙粉虱。

在陜西不同地區(qū)中以大荔、臨渭、渭城、涇陽、鄠邑、高陵、丹鳳、石泉、靖邊等縣(區(qū))煙粉虱種群比例較高，種群數(shù)量占比在95%以上；臨潼、商州、寶塔、安塞等縣(區(qū))次之，煙粉虱占比在85%左右；洋縣占比最低，為67.2%。

不同寄主作物上煙粉虱與白粉虱的數(shù)量結(jié)構(gòu)差異顯著不同，煙粉虱在參試的10種蔬菜上均有為害，白粉虱僅在番茄、黃瓜、辣椒、菜豆、南瓜上為害。白粉虱種群數(shù)量明顯低于同一寄主上煙粉虱的數(shù)量。

日光溫室、冷棚、露地3種栽培模式條件下，煙粉虱的種群數(shù)量以溫室中為最大，白粉虱的種群數(shù)量以露地為最大，煙粉虱較白粉虱更能適應(yīng)7-8月的高溫環(huán)境，白粉虱對(duì)5月及9月的低溫環(huán)境較為適應(yīng)，兩種粉虱的種群數(shù)量構(gòu)成以煙粉虱為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群。

對(duì)陜西13個(gè)地區(qū)的煙粉虱種群的CO1基因序列檢測(cè)結(jié)果表明，陜西的煙粉虱生物型均為Q型煙粉虱。由系統(tǒng)聚類樹可見，陜西Q型煙粉虱與國外其他地區(qū)的Q型煙粉虱聚為一支。

煙粉虱和白粉虱是先后入侵中國的重要害蟲，兩者的形態(tài)、為害特征及生活史非常相似、生態(tài)位重疊普遍，兩者的種群動(dòng)態(tài)及相互之間的影響關(guān)系十分復(fù)雜[13]。在寄主植物、季節(jié)活動(dòng)時(shí)間的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)中，煙粉虱和白粉虱并未完全重疊，兩種粉虱對(duì)寄主植物有不同的偏好性，白粉虱具有比煙粉虱更寬的溫度范圍，這一研究結(jié)果與褚棟等[14]對(duì)山東的粉虱種群動(dòng)態(tài)分布研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，陜西境內(nèi)不同地區(qū)的煙粉虱與白粉虱在長(zhǎng)期的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)過程中，煙粉虱作為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)種群，但并未完全取代白粉虱。煙粉虱作為一個(gè)由多種生物型組成的復(fù)合種[15-19]，在不同區(qū)域的生物型分布是不均勻的。趙瑞華等[20]在2015年的研究結(jié)果表明， B型和Q型煙粉虱是陜西地區(qū)的主要生物型，其中B型煙粉虱占所測(cè)總樣本的78.85%，但Q型種群比例在增長(zhǎng)，結(jié)合本研究對(duì)陜西13個(gè)地點(diǎn)的煙粉虱生物型鑒定結(jié)果，說明Q型煙粉虱在陜西的擴(kuò)散速度非常快，目前已經(jīng)取代B型煙粉虱在陜西的分布。Q型煙粉虱在關(guān)中地區(qū)的種群數(shù)量更大，煙粉虱不同生物型在寄主范圍、傳毒能力、地理分布及抗藥性等方面存在顯著差異[21-22],研究明確不同地區(qū)粉虱的數(shù)量結(jié)構(gòu)和種群比例對(duì)科學(xué)、合理的進(jìn)行綜合防控具有十分重要的意義，本研究初步明確陜西地區(qū)的煙粉虱與白粉虱的數(shù)量結(jié)構(gòu)和煙粉虱的生物型，對(duì)陜西地區(qū)的防控提供理論依據(jù)。