蜻蜓鳳梨 AfACO1基因的克隆及乙烯響應(yīng)特性分析

雷 明，王加賓，李志英，徐 立

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571700；2.農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571700；3.海南省熱帶作物種質(zhì)資源遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571700；4.國家種質(zhì)資源熱帶作物中期保存庫，海南儋州 571700)

鳳梨科(Bromeliaceae)植物包括58個(gè)屬3 248個(gè)種，形態(tài)多樣，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)[1-2]。人工栽培的鳳梨可以分為2大類，一類是食用鳳梨，即菠蘿(Ananascomosus)，一類是觀賞鳳梨。觀賞鳳梨形態(tài)多樣、花期持久，雖然自20世紀(jì)90年代中期傳入中國到現(xiàn)在不過30來年的時(shí)間，但市場(chǎng)發(fā)展迅速，已成為僅次于蘭花和紅掌的第3大熱帶花卉。

乙烯是一種重要的植物激素，參與種子萌發(fā)、幼苗生長、開花誘導(dǎo)、果實(shí)成熟、器官衰老和病原菌響應(yīng)等諸多過程[3-4]。乙烯生物合成起始于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)。從SAM合成乙烯需要2個(gè)關(guān)鍵的限速酶[5-6]。首先，在1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACC)合成酶(ACC synthase，ACS)的作用下，SAM被催化成ACC。其次，在ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)的作用下，ACC被催化成乙烯。通常植物內(nèi)源乙烯一直維持在較低的水平，但生長發(fā)育階段及脅迫處理會(huì)使其表達(dá)迅速上調(diào)，而在這個(gè)過程中，ACO至關(guān)重要[7-9]。ACO屬于2OG-加氧酶超家族，該家族的酶利用非血紅素Fe2+為輔因子，將分子氧整合進(jìn)其他生物分子中。該家族的諸多成員具有一個(gè)高度保守的Fe2+結(jié)合基序，該基序由2個(gè)組氨酸和1個(gè)酸性氨基酸殘基(Glu/Asp)組成[10-12]。ACO的反應(yīng)底物為抗壞血酸，且需要CO2為激活因子[13]。

施加外源乙烯或乙烯衍生物(如乙烯利、乙炔等)可以促進(jìn)鳳梨科植物開花。利用14C 標(biāo)記的乙烯利處理菠蘿，4 h時(shí)，30%的乙烯利進(jìn)入葉片，24 h時(shí)，60%的乙烯利進(jìn)入葉片[14]。施用內(nèi)源乙烯合成抑制劑aminoethoxyvinylglycine(AVG)能夠延遲菠蘿的自然開花時(shí)間，且乙烯誘導(dǎo)開花的時(shí)間也延長了[15-17]。因此，乙烯誘導(dǎo)鳳梨科植物開花主要是外源乙烯引起內(nèi)源乙烯含量增加所致。但到目前為止，鮮有關(guān)于鳳梨科植物內(nèi)源乙烯合成關(guān)鍵酶ACO編碼基因的克隆和功能鑒定的報(bào)道。

蜻蜓鳳梨(Aechmeafasciata)是一種廣泛栽培的觀賞鳳梨品種。本研究首次從蜻蜓鳳梨中克隆了ACO家族編碼基因AfACO1，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄本的組織表達(dá)特異性，并研究其響應(yīng)外源乙烯處理的表達(dá)模式。為進(jìn)一步解析AfACO1在內(nèi)源乙烯合成中的作用以及通過基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物開花提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

蜻蜓鳳梨取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚(30～32 ℃)。幼株和成株分別為試管苗移栽成活后株齡6個(gè)月和11～14個(gè)月的植株。外源乙烯利處理時(shí)，分別取20 mL 不同試驗(yàn)質(zhì)量濃度(0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 g/L)的乙烯利灌心處理1、2、4、8、24、48 h，以清水灌心的材料為對(duì)照。不同組織材料在處理后迅速于液氮中冷凍，置于-80 ℃保存，備用。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

采用改良的CTAB法提取蜻蜓鳳梨總RNA。cDNA第1條鏈的合成采用TranScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(Transgene)，具體過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 5′和3′ RACE

首先參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的說明書合成5′和3′ RACE模板。根據(jù)已有的414 bp的序列，分別設(shè)計(jì)了5′和3′特異引物進(jìn)行全長cDNA的擴(kuò)增。其中，5′的外側(cè)引物GSP51和內(nèi)側(cè)引物GSP52以及3′的外側(cè)引物GSP31和內(nèi)側(cè)引物GSP32的序列見表1。采用OMEGA(Omega)的膠回收試劑盒純化PCR條帶。純化后的特異條帶分別連接到pEASY-blunt克隆載體上，測(cè)序。測(cè)序后的條帶與轉(zhuǎn)錄組序列拼接后再做進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)分析；利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)；利用MEGA 6.0軟件和鄰接法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建；利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析蛋白質(zhì)的保守基序；利用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。

1.5 總DNA的提取及 AfACO1基因組序列的克隆

采用改良的CTAB法提取蜻蜓鳳梨的總DNA。依據(jù)AfACO1的CDS序列設(shè)計(jì)引物(AfACO1CDS F和AfACO1CDS R)以DNA為模板擴(kuò)增AfACO1的基因組序列。具體引物序列參見表1。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)

PCR反應(yīng)選用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Transgene)在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)上進(jìn)行。反應(yīng)體系(10 μL)：qPCR混合反應(yīng)液SuperMix 5 μL，模板1 μL，正反向引物各0.3 μL，滅菌的去離子水補(bǔ)齊至10 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min，然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后65 ℃ 30 s，20 ℃停止。每個(gè)樣品2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。以蜻蜓鳳梨的β-actin(AfACTB)為內(nèi)參采用雙delta法分析數(shù)據(jù)。目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。所有引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfACO1 cDNA全長的克隆與序列分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得1個(gè)與擬南芥ACO基因同源的片段?；诖耍O(shè)計(jì)了RACE擴(kuò)增引物，分別擴(kuò)增得到了該基因的5′端序列和3′端序列(圖1-A和B)。在此基礎(chǔ)上，成功克隆了AfACO1cDNA 732 bp的全長(圖1-C)。分析后發(fā)現(xiàn)，其含有1個(gè)63 bp的5′非編碼區(qū)(5′ untrascriptional region，5′-UTR)，1個(gè)198 bp的3′-UTR，以及1個(gè)471 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼156個(gè)氨基酸殘基。

基于AfACO1的ORF序列，筆者從蜻蜓鳳梨的DNA中克隆了AfACO1基因的全長，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同于擬南芥的5個(gè)ACOs基因和水稻中的2個(gè)ACO1-likes基因序列結(jié)構(gòu)，AfACO1基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成(圖2)。基因結(jié)構(gòu)的差異暗示AfACO1可能具有某些功能上的差異性。

2.2 AfACO1蛋白的同源性和進(jìn)化樹分析

ProtParam在線軟件計(jì)算結(jié)果顯示，AfACO1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為17.47 ku，等電點(diǎn)為8.46。為了探究AfACO1與其他物種中ACOs蛋白的進(jìn)化關(guān)系，用鄰接法(the neighbor-joining method，NJ method)構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，AfACO1與水稻(Oryzasativaspp.japonicacv.Nipponbare)中的2個(gè)OsACO1-like蛋白親緣關(guān)系最近，暗示它們?cè)诠δ苌峡赡芫哂幸欢ǖ谋Ｊ匦?圖3)。

基于進(jìn)化樹分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)AfACO1蛋白的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示，AfACO1具有ACO的典型結(jié)構(gòu)特征，即分別有輔因子亞鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(His-Xaa-Asp-Asp-Xaa-His)以及ACO家族蛋白輔助底物抗壞血酸結(jié)合位點(diǎn)(Arg-Xaa-Ser)(圖4)，暗示AfACO1可能是蜻蜓鳳梨中功能ACO。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

A.RACE PCR擴(kuò)增 AfACO1 cDNA的5′端序列 RACE PCR amplification of 5′ fragments of AfACO1 cDNA；B.RACE PCR擴(kuò)增 AfACO1 cDNA的3′端序列 RACE PCR amplification of 3′ fragments of AfACO1 cDNA；C.PCR擴(kuò)增 AfACO1 cDNA的全長 PCR amplification of full length of AfACO1 cDNA；M.DL2000 marker

為了進(jìn)一步探究AfACO1可能的功能，利用MEME在線軟件對(duì)其全序列中的保守基序進(jìn)行解析。由圖5可知，相對(duì)于擬南芥的5個(gè)ACOs的8或9個(gè)基序數(shù)量來說，AfACO1的保守基序較少，只有4個(gè)，且這4個(gè)基序的序列更類似于水稻中的2個(gè)ACO1-likes的保守基序。

2.3 AfACO1在蜻蜓鳳梨中的表達(dá)特性

為了研究AfACO1在蜻蜓鳳梨各組織中的表達(dá)特性，提取了蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株的外葉、心葉、莖和根的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)。AfACO1的轉(zhuǎn)錄本在抽薹39 d后的成株的心葉和根中有顯著高的表達(dá)，而在各個(gè)生長時(shí)期的莖中表達(dá)量一直較低(圖6-A)。此外，還檢測(cè)了AfACO1在抽薹39 d后的成株的各生殖器官中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)除了心皮外，其他各組織中AfACO1的表達(dá)量均很低(圖6-B)。

黃色矩形代表外顯子，黑色實(shí)線代表內(nèi)含子 Yellow rectangles and black solid lines indicate exons and introns, respectively; AfACO1.蜻蜓鳳梨 ACO1 ACO1 of Aechemia fasciata； AtACO1.擬南芥 ACO1 ACO1 of Arabidopsis thaliana； AtACO2 .擬南芥 ACO2 ACO2 of Arabidopsis thaliana； AtACO4 .擬南芥 ACO4 ACO4 of Arabidopsis thaliana； AtACO5.擬南芥 ACO 5 ACO5 of Arabidopsis thaliana；LOC_Os08g30240.1.水稻的ACO1-like ACO1-like of Oryza sativa spp. japonica cv.Nipponbare；LOC_Os09g39720.1.水稻的ACO1-like ACO1-like of Oryza sativa spp. japonica cv.Nipponbare

圖3 AfACO1分子的進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic analysis of AfACO1 and ACO proteins of other species

紅色矩形處為亞鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色橢圓處為抗壞血酸結(jié)合位點(diǎn) Red rectangles indicate the binding site of Fe2+, and the blue oval indicates the binding site of ascorbic acid

不同顏色的矩形代表不同的基序 The color boxes represent different putative motifs

A. AfACO1在蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株(39-day-after-flowering(DAF) adult plants)各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfACO1 in variable tissues of juvenile plants, adult plants before flowering, and 39-day-after-flowering(DAF) adult plants；B. AfACO1在抽薹39 d后的成株?duì)I養(yǎng)器官和生殖器官中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfACO1 in vegetative and reproductive organs of 39 day adult plants

2.4 AfACO1對(duì)外源乙烯處理的響應(yīng)特性

外源乙烯可通過啟動(dòng)內(nèi)源乙烯合成來促進(jìn)鳳梨科植物開花。為了檢測(cè)AfACO1是否是內(nèi)源乙烯合成的關(guān)鍵酶，通過施加不同質(zhì)量濃度的外源乙烯利后，檢測(cè)蜻蜓鳳梨成株心葉中AfACO1轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量變化。由圖7可知，AfACO1的表達(dá)在乙烯利處理的4 h內(nèi)幾乎無變化，但是隨后顯著受乙烯利誘導(dǎo)，表達(dá)量持續(xù)上升。有意思的是，AfACO1的表達(dá)似乎不受外源乙烯利質(zhì)量濃度的影響。

圖7 施加不同質(zhì)量濃度乙烯利后蜻蜓鳳梨成株心葉中 AfACO1的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of AfACO1 in central leaves of Aechmea fasciata adult plants treated with exogenous ethephon

3 討 論

作為一種氣態(tài)激素，乙烯調(diào)控植物生長發(fā)育的諸多方面，包括開花[18-19]。乙烯可以通過赤霉素途徑增加DELLA蛋白的累積，從而抑制擬南芥開花[18]。與對(duì)擬南芥的作用相反，外源乙烯可以促進(jìn)鳳梨科植物開花。到目前為止，已挖掘到部分響應(yīng)乙烯或乙烯信號(hào)通路調(diào)控鳳梨科植物開花的基因[20-21]。此外，沉默乙烯合成途徑中的一個(gè)限速酶ACACS2后，菠蘿開花顯著延遲[22]。

ACO是乙烯合成途徑中的最后一個(gè)酶，也是除了ACS外的另一個(gè)限速酶，對(duì)底物有高度的專一性。1985年，調(diào)控番茄果實(shí)成熟的基因pTOM13被克隆，并最終在1991年被鑒定為乙烯形成酶(Ethylene-forming enzyme，EFE)基因，即ACO，這也是第一個(gè)被克隆的ACO基因[23-26]。目前，除番茄外，ACO基因已經(jīng)在擬南芥、蘋果、甜瓜、黃瓜、桃、油棕等多種植物中被克隆[27-32]，但尚未見鳳梨科植物中ACO基因克隆和功能鑒定的報(bào)道。

本研究首次從蜻蜓鳳梨中克隆了一個(gè)ACO基因，并將其命名為AfACO1。相對(duì)而言，AfACO1的基因序列長度較短(圖2)，且只有一個(gè)內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)與擬南芥中的ACOs均不一樣(圖2)。但是AfACO1的蛋白序列中有高度保守的Fe2+離子結(jié)合位點(diǎn)以及抗壞血酸結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果證實(shí)，這2個(gè)位點(diǎn)是ACO利用抗壞血酸為底物、CO2為激活子、Fe2+為輔因子來合成乙烯的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[33-37]。此外，結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AfACO1具有與擬南芥和水稻的ACOs類似的保守基序(圖5)。這些結(jié)果表明，AfACO1可能是個(gè)功能性的ACO，在乙烯合成過程中起重要作用。

ACOs是家族基因，例如，番茄中有6個(gè)ACOs[38]，黃瓜中發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)ACOs[31, 39]，蘋果中有3個(gè)ACOs[30]。不同物種或同一物種的不同ACOs的時(shí)空表達(dá)模式不盡相同。番茄的LeACO1主要在花的翼瓣和柱頭表達(dá)，LeACO2只在花藥中表達(dá)，LeACO3則是除了萼片外，在其他花組織中均表達(dá)。此外，在果實(shí)成熟期，LeACO1的表達(dá)顯著升高；LeACO3的表達(dá)則在果實(shí)躍變期，而LeACO4則在整個(gè)果實(shí)成熟期均表達(dá)[40]。為了更好地探究AfACO1可能的功能，筆者檢測(cè)了其在蜻蜓鳳梨生長發(fā)育各個(gè)階段的各營養(yǎng)器官和生殖器官中的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。AfACO1在幼株和開花前的成株大部分器官中的表達(dá)模式類似，即在外葉中的表達(dá)量相對(duì)較高，而在心葉和莖中表達(dá)量很低或檢測(cè)不到其表達(dá)(圖6-A)。但在抽薹39 d的成株中，AfACO1的表達(dá)量在莖中升高了，而在心葉中則顯著上升，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各生長階段外葉中的表達(dá)量(圖6-A)。這種在花發(fā)育時(shí)期的營養(yǎng)器官中的高表達(dá)模式暗示，AfACO1可能是生殖生長階段乙烯合成的關(guān)鍵酶。

ACO基因的表達(dá)也受乙烯、脫落酸等激素以及非生物脅迫的誘導(dǎo)。例如，脫落酸處理可以誘導(dǎo)番茄LeACO1的表達(dá)[41]，水楊酸能顯著下調(diào)桃果實(shí)中PpACO1的表達(dá)，顯著上調(diào)PpACO2的表達(dá)[28]，而生長素能完全抑制乙烯誘導(dǎo)后的水稻OsACO3的表達(dá)[42]。自20世紀(jì)30年代以來，利用乙烯或乙烯衍生物促進(jìn)鳳梨科植物開花就已經(jīng)成為生產(chǎn)者普遍采用的措施。研究表明，施加外源乙烯促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成，進(jìn)而促進(jìn)鳳梨科植物開花[14-17]。為了探究AfACO1對(duì)外源乙烯處理的響應(yīng)，筆者使用不同質(zhì)量濃度的乙烯利對(duì)蜻蜓鳳梨成株進(jìn)行灌心處理。由圖7可知，在外源乙烯利處理的4 h內(nèi)，AfACO1的表達(dá)幾乎沒有變化。前期筆者曾發(fā)現(xiàn)，乙烯下游的一個(gè)調(diào)控開花的基因AfAP2-1可以在外源乙烯處理的1 h即迅速下調(diào)[20]。這表明，除了AfACO1外，蜻蜓鳳梨中可能還存在其他的ACO同源基因可以迅速響應(yīng)外源乙烯利的處理，促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成，進(jìn)而通過乙烯信號(hào)通路調(diào)控下游開花相關(guān)基因的表達(dá)。

從外源乙烯利處理8 h開始，AfACO1的表達(dá)逐漸上調(diào)，表明AfACO1在乙烯后期的合成中發(fā)揮著重要作用。更有趣的是，不同質(zhì)量濃度的乙烯利處理后，AfACO1的表達(dá)模式均很相似，且同一時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量也近乎相同(圖7)，表明一次性施加20 mL 0.3 g/L的外源乙烯利，已經(jīng)達(dá)到誘導(dǎo)AfACO1表達(dá)的閾值，更高質(zhì)量濃度的乙烯利處理并不能通過提高AfACO1的表達(dá)來促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成。

盡管乙烯促進(jìn)鳳梨科植物開花顯而易見，但分子機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。ACO是調(diào)控內(nèi)源乙烯合成的家族基因，因此，克隆更多的蜻蜓鳳梨ACO基因，研究它們的時(shí)空表達(dá)模式以及編碼蛋白酶的生物學(xué)功能，結(jié)合基因工程手段最終探究ACO在乙烯誘導(dǎo)鳳梨科植物開花中的作用，將是今后研究的重要方向之一。