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    桃果實(shí)番茄紅素β-環(huán)化酶基因的克隆及表達(dá)分析

    2019-01-29 06:16:42梁敏華楊震峰蘇新國(guó)宋春波
    關(guān)鍵詞:番茄紅素胡蘿卜素結(jié)構(gòu)域

    梁敏華,楊震峰,蘇新國(guó),宋春波

    (1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 食品學(xué)院,廣州 510520;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江寧波 315100;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,廣州 510640)

    桃(PrunuspersicaL.),原產(chǎn)于中國(guó),為薔薇目薔薇科多年生大型木本植物,其果實(shí)色、香、味俱全,營(yíng)養(yǎng)豐富。按照果實(shí)色澤分類,現(xiàn)在市場(chǎng)上的桃果實(shí)可分為白肉桃、紅肉桃和黃肉桃,其中黃肉桃果實(shí)中的主要色素成分為類胡蘿卜素[1]。類胡蘿卜素是一類天然植物色素的總稱,共軛雙鍵的分子結(jié)構(gòu)使得其在可見(jiàn)光條件下可呈黃、橙、紅3種顏色或以上3種顏色的混合色[2-3]。

    番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase,LCYb)是催化類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素向β-胡蘿卜素或其他含β環(huán)的類胡蘿卜素組分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶[4]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明隨著果實(shí)發(fā)育成熟進(jìn)程的推進(jìn),果實(shí)中番茄紅素或含β環(huán)的類胡蘿卜素含量變化與LCYb基因的表達(dá)密切相關(guān)[5-7]。研究表明,成熟時(shí)期的黃肉桃果實(shí),其類胡蘿卜素的主要組分為β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和玉米黃素等[1, 8]。目前,有關(guān)桃果實(shí)中LCYb基因表達(dá)與β-胡蘿卜素和β-隱黃素等含β環(huán)類胡蘿卜素含量積累之間聯(lián)系的研究鮮有報(bào)道,桃果實(shí)中LCYb基因的分離和鑒定研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以黃肉品種桃果實(shí)為試材,采用基因克隆技術(shù)從桃果實(shí)中獲得LCYb基因全長(zhǎng)序列,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況,為闡明其在桃果實(shí)類胡蘿卜素生物合成與積累過(guò)程的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 植物材料 產(chǎn)自浙江奉化的黃肉品種桃果實(shí)‘金麗’是本試驗(yàn)主要材料。當(dāng)果實(shí)發(fā)育處于盛花后35~45 d、55~65 d、95~105 d、105~120 d、120~150 d 5個(gè)階段,也就是果實(shí)分別發(fā)育至軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期時(shí)進(jìn)行采樣,分別選取大小均勻、無(wú)蟲(chóng)害及無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.1.2 主要試劑 美國(guó)Omega公司的植物RNA提取試劑盒用于提取桃果實(shí)總RNA;北京康為世紀(jì)公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒用于合成反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA;日本TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒用于擴(kuò)增目的基因3′、5′末端序列;美國(guó)Thermo公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成 桃果實(shí)果皮和果肉總RNA的提取采用Omega公司的植物RNA提取試劑盒并按說(shuō)明操作。在提取總RNA的過(guò)程中,為防止總RNA中混雜的微量DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的干擾,加入適量無(wú)Rnase活性的DNaseⅠ酶液。反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA的合成采用康為世紀(jì)公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒并按說(shuō)明操作。

    1.2.2 LCYb基因序列克隆與生物信息學(xué)分析 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索與桃果實(shí)LCYb氨基酸序列同源性較高的其他植物物種LCYb氨基酸序列。比對(duì)查找上述氨基酸序列的保守區(qū)域,并通過(guò)在線軟件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在上述保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板,采用簡(jiǎn)并引物法PCR擴(kuò)增LCYb基因中間核苷酸序列片段,PCR程序如下:94 ℃預(yù)變性2 min,然后進(jìn)行33個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min),72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測(cè)序后得到基因的中間核苷酸序列片段。采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒,按照說(shuō)明,以簡(jiǎn)并引物法得到的LCYb基因核苷酸序列片段為模板分別設(shè)計(jì)LCYb基因3′、5′末端序列擴(kuò)增特異性引物(表1)進(jìn)行3′、5′末端序列PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測(cè)序后得到LCYb基因3′、5′末端核苷酸序列片段。

    表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

    注Note:*R=A/G;Y=C/T。

    1.2.3 LCYb基因生物信息學(xué)分析 基因全長(zhǎng)cDNA序列拼接采用DNAMAN5.2.2軟件?;蚓幋a區(qū)、編碼基因、蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org)。氨基酸序列比對(duì)分析采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneDoc2.7.0軟件。蛋白亞細(xì)胞定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用在線軟件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及展示采用SWISS-MODEL服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org)?;蛳到y(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析采用MEGA 5.1 軟件。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 基因表達(dá)情況分析采用美國(guó)Thermo公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行。按照試劑盒操作說(shuō)明,以上述克隆所得LCYb基因全長(zhǎng)核苷酸序列的編碼區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)。分別加入1 μL cDNA、1 μL上游引物(100 μmol/L)、1 μL下游引物(100 μmol/L)、13 μL SYBR Green PCR混合液、9 μL DEPC水混合成25 μL PCR反應(yīng)體系。95 ℃預(yù)變性7 min,然后95 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,重復(fù)上述步驟40次。以PpTEF2作為內(nèi)參基因[9],每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),并進(jìn)行陰性對(duì)照。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2-ΔΔCT法對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)分析,不同批次及不同果實(shí)組織中基因的表達(dá)情況比較采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析(P≤0.05),采用OriginPro 9.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LCYb基因的克隆與凝膠分析

    通過(guò)簡(jiǎn)并引物法得到的LCYb基因凝膠電泳條帶清晰,測(cè)序得到長(zhǎng)度為606 bp的序列片段(圖1)。通過(guò)3′RACE擴(kuò)增技術(shù)得到LCYb基因3′端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶稍暗,經(jīng)后期純化富集測(cè)序仍能得到長(zhǎng)度為706 bp的序列片段(圖1)。通過(guò)5′RACE擴(kuò)增技術(shù)得到的LCYb基因3′端凝膠電泳條帶清晰,測(cè)序得到長(zhǎng)度為1 027 bp的序列片段(圖1)。準(zhǔn)確拼接上述3段序列得到桃果實(shí)LCYb基因的全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)度為1 699 bp。通過(guò)調(diào)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有序列數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)顯示,上述克隆獲得的LCYb基因全長(zhǎng)序列與玫瑰LCYb基因(NCBI搜索號(hào):KP768074)和草莓LCYb基因(NCBI搜索號(hào):JN979375)全長(zhǎng)序列同源性分別達(dá)88%和86%,因此將它命名為PpLCYb。具體克隆成果已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),搜索號(hào)為KJ789377。

    M.100 bp DNA Marker;1.RT-PCR產(chǎn)物 The product of RT-PCR;2.3′RACE產(chǎn)物 The product of 3′RACE;3.5′RACE產(chǎn)物 The product of 5′RACE

    2.2 LCYb基因生物學(xué)分析

    2.2.1 基本理化性質(zhì)分析PpLCYb基因具有完整的基因編碼區(qū),長(zhǎng)度為1 515 bp,編碼504個(gè)氨基酸,呈酸性的天冬氨酸、谷氨酸個(gè)數(shù)為54個(gè),呈堿性的精氨酸、賴氨酸個(gè)數(shù)為61個(gè),等電點(diǎn)為8.76,呈弱堿性。所編碼的蛋白分子式為C2587H4011N689O719S25,分子質(zhì)量為57.1 ku,性質(zhì)不穩(wěn)定,脂溶指數(shù)85.32,親水指數(shù)-0.163,易溶于水。

    2.2.2 氨基酸序列比對(duì)與功能結(jié)構(gòu)域分析 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)從其他植物物種中在線搜得到9條與PpLCYb基因編碼的氨基酸同源性較高的氨基酸序列。氨基酸序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖2,在PpLCYb基因編碼的氨基酸序列上同樣存在著所有LCYb基因編碼的氨基酸序列所擁有的共同特征結(jié)構(gòu)域(第61~502位氨基酸),這段特征結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟DR超級(jí)家族。第89~453位氨基酸屬于番茄紅素環(huán)化酶蛋白特征編碼區(qū),如LCYb和ε-環(huán)化酶等,其中第287~292位氨基酸存在著LCYb特征序列(LYAMPF),第363~381位氨基酸為NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)。

    2.2.3 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 采用BLAST軟件將PpLCYb基因編碼的氨基酸序列與已在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的其他植物物種LCYb氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,結(jié)果顯示(圖3),PpLCYb與同屬薔薇目的草莓FaLCYb(gi|498663613)聚類于一個(gè)小分支內(nèi),親緣性好,可信度高。

    2.2.4 蛋白亞細(xì)胞定位與二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示PpLCYb蛋白定位在葉綠體上,但可信度僅為67%,后期仍需做進(jìn)一步的試驗(yàn)分析驗(yàn)證。二級(jí)構(gòu)件中α-螺旋元件占30.36%,無(wú)規(guī)則卷曲元件占58.93%,β-折疊元件占10.71%,其中無(wú)規(guī)則卷曲元件占主要比例,β-折疊元件占比較少,這與使用SWISS-MODEL服務(wù)器預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果基本吻合(圖4)。

    2.3 PpLCYb基因在桃果實(shí)不同發(fā)育組織中的表達(dá)分析

    由表1設(shè)計(jì)好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物所引發(fā)的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增效率為95%,處于90%~110%合理范圍區(qū)間,擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線在溫度為84.5 ℃時(shí)出現(xiàn)溶解單峰,擴(kuò)增特異性強(qiáng),以上數(shù)據(jù)表明設(shè)計(jì)好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物可用于桃果實(shí)PpLCYb基因表達(dá)情況分析。在桃果實(shí)整個(gè)發(fā)育期間,PpLCYb基因無(wú)論在果實(shí)果皮還是果肉中均有表達(dá)(圖5)。隨著桃果實(shí)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn),PpLCYb基因在果實(shí)中的表達(dá)總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),并在果實(shí)處于硬熟期時(shí)達(dá)到較大值,隨后在完熟期略有下降,但在這個(gè)過(guò)程中,PpLCYb基因在果皮和果肉中的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果初步表明,PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)發(fā)育成熟程度在果實(shí)發(fā)育前期(軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期)是呈正相關(guān)的,PpLCYb基因可能誘導(dǎo)了桃果實(shí)的發(fā)育成熟。

    a.蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) Protein functional domains prediction;b.基酸序列同源性比較 Homology comparison of putative amino acids’sequence

    圖3 桃果實(shí)PpLCYb基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of PpLCYb gene

    圖4 桃果實(shí)PpLCYb蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The deduced three-dimensional structure of PpLCYb protein

    相同字母表示在0.05水平上差異不顯著 The same letter means non-significant difference at 0.05 levels

    3 討 論

    目前,已從與桃果實(shí)同屬薔薇目薔薇科的草莓(Fragariaxananassa)(NCBI搜索號(hào):JN979375)、枇杷(Eriobotryajaponica)(NCBI搜索號(hào):JX089591)、歐李(Prunushumilis)(NCBI搜索號(hào):KR866276)、蘋(píng)果(Malusdomestica)(NCBI搜索號(hào):KU508827)等果實(shí)中分離出LCYb基因全長(zhǎng)序列,它們長(zhǎng)度普遍處于1 650~1 900 bp之間,編碼495~505個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn),植物中LCYb基因是一個(gè)大家族,不同物種中LCYb所編碼的氨基酸序列也有很大差異[10],這種現(xiàn)象在本研究中也同樣存在,研究結(jié)果顯示不同植物物種LCYb所編碼的氨基酸序列N端差異性比較大(圖2),這可能是不同植物進(jìn)化的結(jié)果。但盡管如此,靠近序列C端依然存在幾個(gè)高度保守區(qū)域,如所有植物L(fēng)CYb所固有的特征結(jié)構(gòu)域LYAMPF和NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)等,這些高度保守的結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與酶的特異性催化功能密切相關(guān)[11-12]。本研究首次從桃果實(shí)中克隆得到PpLCYb基因全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)度為1 699 bp,編碼504個(gè)氨基酸,氨基酸序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析顯示其上同樣存在著LCYb特征結(jié)構(gòu)域和NAD(P)/FAD結(jié)合域,這表明本研究的克隆分析結(jié)果客觀可信。

    LCYb是控制類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素發(fā)生環(huán)化作用的重要限速酶,LCYb基因表達(dá)水平增高能加快β-胡蘿卜素或其他含有β環(huán)結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素的積累,LCYb基因表達(dá)水平降低則會(huì)導(dǎo)致番茄紅素的積累[13]。Ambrosio等[14]通過(guò)基因工程技術(shù)誘導(dǎo)番茄果實(shí)中LCYb基因進(jìn)行超量表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實(shí)中大量積累β-胡蘿卜素。紅肉品種柑橘發(fā)育過(guò)程中,果實(shí)果皮和果肉中LCYb基因的表達(dá)水平較低,這可能與果實(shí)中番茄紅素的大量積累有關(guān)[15-17]。Wisutiamonkul等[18]研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃貯藏條件下,‘Chanee’榴蓮果實(shí)總類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的含量與果實(shí)中LCYb基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。增強(qiáng)黃肉品種番木瓜中LCYb基因的表達(dá),果實(shí)中番茄紅素含量一直保持較低的水平,而β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則顯著增高,此外,抑制紅肉品種番木瓜中LCYb基因的表達(dá),果實(shí)中番茄紅素含量持續(xù)增加,β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則基本保持較低水平[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著桃果實(shí)發(fā)育成熟進(jìn)程的推進(jìn),PpLCYb基因在果實(shí)中的表達(dá)逐漸增高并在果實(shí)發(fā)育處于硬核期時(shí)達(dá)到較大值,隨后在果實(shí)完熟期時(shí)略有下降。這表明PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程是基本上呈正相關(guān)的,PpLCYb基因可能參與到果實(shí)成熟過(guò)程中色澤品質(zhì)的調(diào)控環(huán)節(jié),但具體分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

    4 結(jié) 論

    本試驗(yàn)首次從桃果實(shí)中成功克隆PpLCYb基因,生物信息學(xué)分析結(jié)果與其他物種已報(bào)道的LCYb基因信息基本一致,但上述預(yù)測(cè)分析結(jié)果有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)的成熟程度基本呈正相關(guān),數(shù)據(jù)表明其可能參與到類胡蘿卜素生物合成的調(diào)控過(guò)程中。以上結(jié)果可為后續(xù)PpLCYb蛋白功能鑒定、結(jié)構(gòu)分析以及桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中類胡蘿卜素的合成調(diào)控等試驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。

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