高效液相色譜法檢測紅糖中的焦糖色素

□ 王秀娟 曹程程 王 姣 楊桂霞 高 恒 山東中質(zhì)華檢測試檢驗(yàn)有限公司

焦糖色素亦稱焦糖，是一種復(fù)雜的混合物，具有膠體性質(zhì)，可由碳水化合物（葡萄糖等）經(jīng)單獨(dú)加熱合成，也可與食用的酸、堿、鹽等共同合成[1]。焦糖色素顏色呈棕黑色至黑色不等，有液體形式存在，也有固體形式存在，在水中完全溶解，在有機(jī)溶劑中幾乎不溶，具有聚合物的性質(zhì)。一般而言，焦糖反應(yīng)具有兩種反應(yīng)機(jī)理[2]：一種是胺參與下，由帶有氨基的葡萄糖反應(yīng)生成雪夫氏堿，再加熱生成氮取代葡基胺的美拉德反應(yīng)。另一種是單純的焦糖化反應(yīng)，即在約200 ℃的高溫下，由碳水化合物生成醛類物質(zhì)，再縮合成染色物質(zhì)。紅糖的生產(chǎn)主要依靠高溫蒸煮，加熱到119 ℃時(shí)，必須將糖液攪動，防止焦化。當(dāng)加熱到124～128 ℃時(shí)，即可起鍋，超過130 ℃時(shí)，就會變焦，極有可能產(chǎn)生焦糖色素類副產(chǎn)物。因此，有必要建立一種快速檢測紅糖中焦糖色素的方法。

由于焦糖色素分子的復(fù)雜性，國內(nèi)并無焦糖色素的檢測方法報(bào)道，目前研究較多是焦糖色素中4-甲基咪唑的研究[3-6]。國外也未有成熟的檢測紅糖中焦糖色素的方法，涉及的相關(guān)檢測方法也比較受限，像光度法、稱重法、電子光譜法等的分離效果、檢測準(zhǔn)確性等均存在一定程度的不足。本文研究采用液相色譜-二極管陣列檢測器檢測紅糖中的焦糖色素，目的是建立一種快速、準(zhǔn)確的有效方法，為焦糖色素的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

老紅糖（赤砂糖）、月子紅糖、阿膠紅糖，購自市場。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀（1260 InfinityⅡ，美國安捷倫公司）、超聲波清洗器（AS30600BDT，天津奧特賽恩斯儀器）、渦旋混合器（XW-80A，上海馳唐）、離心機(jī)（3-18KS，德國賽默飛）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（BGZ-246，上海博訊）。

焦糖色素，購自上海愛普公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇，分析純；磷酸二氫鈉，分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液體焦糖的純化

準(zhǔn)確稱取8 g（精確至0.001 g）液體焦糖于50 mL的離心管中，以4∶1的比例向離心管中加入乙醇和水（24 mL無水乙醇+6 mL 水），旋渦3 min，超聲30 min（45 ℃）。取出后，低速（2 000 r/min）離心3 min，棄去上層液體。重復(fù)上述過程三次。將最終得到的固體沉淀物在烘箱中80 ℃烘干至恒重。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制作

準(zhǔn)確稱取純化后的焦糖色素100 mg至10 mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為10 mg/mL。

分別移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）。

1.3.3 色譜條件

色譜柱Agela SCX5，0μm，4.6 mm×250 mm；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動相為0.01 mol/L的磷酸二氫鈉緩沖鹽；色譜時(shí)間10 min，等度洗脫；檢測器掃描波長范圍190～620 nm，定量波長610 nm。

1.3.4 樣品前處理

分別稱取2.5 g老紅糖（赤砂糖）、月子紅糖、阿膠紅糖的樣品于離心管中，加入2.5 mL水、10 mL無水乙醇，渦旋混勻3 min，2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入少量水溶解沉淀物，渦旋混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加水定容至刻度，振蕩混勻。溶液過0.22 μm濾膜后上機(jī)測試。

1.3.5 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

以三種紅糖樣品為基質(zhì)，分別進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為500 mg/kg和1 000 mg/kg兩個(gè)水平，加標(biāo)后的樣品需靜置半小時(shí)，之后與樣品進(jìn)行同步處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體焦糖的純化

焦糖色素是一種復(fù)雜的混合物，其中包括了很多雜質(zhì)，像一些小分子的低聚糖、水等，另外還有一些色素成分。因此液體焦糖在使用之前需進(jìn)行純化，這樣可以使其響應(yīng)值大大提高。乙醇/水（4+1）沉淀法是一種簡單易行、效果好的方法。本研究采用此法對液體焦糖進(jìn)行純化，圖1為純化前后的液體焦糖色譜圖，在圖中可看出純化后的液體焦糖響應(yīng)值約為純化前的三倍。

2.2 色譜條件的選擇

李祥等的研究中測定了焦糖色素所帶電荷為正電荷，且陳意光的研究中比較了食品中焦糖色素在C18色譜柱、氨基柱和強(qiáng)陽離子交換柱上的分離效果，綜合研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇強(qiáng)陽離子交換柱作為焦糖色素的分離色譜柱。

試驗(yàn)中選擇磷酸二氫鈉為流動相，分別比較了10、20、30 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液的分離效果。結(jié)果表明，前兩者無明顯差異，后者導(dǎo)致焦糖色素的色譜峰變寬。本著節(jié)約成本的原則，試驗(yàn)中流動相選擇10 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液。結(jié)合研究報(bào)道中的結(jié)果得出在610 nm處基質(zhì)干擾較少，因此定量波長選擇610 nm。

2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

因紅糖屬于成分較為復(fù)雜的樣品，所以在上機(jī)檢測前需進(jìn)行除雜處理，乙醇/水沉淀法可有效去除有機(jī)小分子雜質(zhì)，純化效果明顯，因此選擇此沉淀法進(jìn)行樣品的除雜。根據(jù)焦糖色素極易溶于水的特點(diǎn)，選用水溶解沉淀物，渦旋混合提取，回收率良好。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以焦糖色素的濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)，計(jì)算得出的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.001x+0.002，線性范圍50～1 000 mg/kg，R2值為 0.999。

圖1 純化前（A）與純化后（B）液體焦糖的色譜圖（1000 mg/L）

圖2 紅糖樣品焦糖色素的色譜圖

表1 樣品中焦糖色素的含量及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 方法的檢出限、精密度和回收率

以三種紅糖為加標(biāo)樣品，分別選取兩個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)平行樣。根據(jù)低濃度添加水平的S/N=3的方式進(jìn)行計(jì)算，得出焦糖色素在紅糖中的檢出限為20 mg/kg。

該方法在三種紅糖基質(zhì)中的平均回收率在88.3%～98.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～5.1%。方法的準(zhǔn)確性和精密度均較好。樣品的色譜圖如圖2所示?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4.3 紅糖中的焦糖色素含量

經(jīng)檢測，選取的三種紅糖中，老紅糖中的含量較之另外兩種高一些，為3 646 mg/kg；阿膠紅糖和月子紅糖中含量分別為2 815 mg/kg和2 568 mg/kg。風(fēng)味紅糖因加入了其他配料，如阿膠粉，因此，焦糖色素的含量相對于老紅糖較低一些。

3 結(jié)論

由于紅糖加工工藝的高溫性特點(diǎn)，成品紅糖中焦糖色素的含量較高。本研究首次建立了紅糖中焦糖色素的高效液相色譜檢測法，前處理簡單，檢出限低，準(zhǔn)確性和精密度較好，是檢測紅糖中焦糖色素的有效方法，應(yīng)用前景良好。