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    大興安嶺野生盤龍參人工組織培養(yǎng)繁殖

    2019-01-24 02:49:54劉德文張春英仲偉利齊會娟湛鑫琳
    關(guān)鍵詞:脂粉盤龍外植體

    ●劉德文 張春英 仲偉利 齊會娟 張 新 湛鑫琳

    (黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學(xué)院 黑龍江 加格達(dá)奇 165000)

    盤龍參為蘭科盤龍參屬植物,學(xué)名綬草(Spiranthes sinensis.(Pers.)Ames.Orch.),又名龍抱柱、盤龍草,株高15~20cm,莖基部簇生數(shù)條肉質(zhì)根。在黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼中、塔河、加格達(dá)奇等地區(qū)有野生分布。盤龍參根或全草入藥,主要含香豆精甙和生物堿,性平,味甘、苦,歸肺經(jīng)、心經(jīng),有滋陰益氣,涼血解毒,澀精,強(qiáng)壯[1]的功效。由于盤龍參植株天然數(shù)量少,目前在上述地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)大面積的盤龍參群落,其種子在自然條件下萌發(fā)率低,給人工栽培帶來困難,有效成分難以富集,阻礙了藥用價(jià)值的應(yīng)用。為了更好地開發(fā)利用這一珍貴的寒溫帶藥用資源,本文作者以盤龍參組織培養(yǎng)為目標(biāo),目的是研究一種以地下隱芽作為外植體進(jìn)行人工組織培養(yǎng)繁殖栽培盤龍參的方法。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以黑龍江省大興安嶺加格達(dá)奇區(qū)野生盤龍參為試驗(yàn)材料。取盤龍參當(dāng)年生地下隱芽為外植體。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 外植體消毒 取盤龍參隱芽外植體,對其進(jìn)行消毒處理:用自來水沖洗5~10分鐘,用75%的(體積)酒精浸泡1~2分鐘,再分別用0.1%(質(zhì)量)的氯化汞及10%(體積)的次氯酸鈉作消毒劑浸泡消毒,最后用無菌水沖洗3~5次。

    不同消毒劑及消毒時(shí)間對比試驗(yàn),結(jié)果見表1。

    1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 外植體消毒后進(jìn)行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。

    初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基:改良MS[7]+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L。

    將外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,給予2 000~2 500Lux的光照,每天光照時(shí)間為12小時(shí),培養(yǎng)溫度 22~24℃,培養(yǎng) 20~25 天[2][3]。

    表1 外植體消毒劑、消毒時(shí)間對比

    圖1 盤龍參外植體-地下隱芽接種

    圖2 外植體-地下隱芽接種15天后膨大

    1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 將經(jīng)過初代培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移培養(yǎng)接種于繼代增殖培養(yǎng)基上,給予2 500~3 000Lux的光照,每天光照時(shí)間為16小時(shí),培養(yǎng)溫度24~26℃,以40~50天為1個(gè)周期進(jìn)行繼待培養(yǎng)[4][8]。

    繼代增殖培養(yǎng)基:MS+BAP+GA3+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L[5][6]。

    繼代過程中在培養(yǎng)基中進(jìn)行了不同激素濃度培養(yǎng)試驗(yàn),其間(接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后)進(jìn)行紅光照射10~15天試驗(yàn),光強(qiáng)1000~1 500Lux的光照,每天光照時(shí)間為16小時(shí),培養(yǎng)溫度24~26℃。

    不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)、增殖對比試驗(yàn),結(jié)果見表2。

    表2 不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)、增殖結(jié)果

    圖3 外植體-地下隱芽接種25天后

    圖4 叢生芽增殖

    1.2.4 生根培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)芽不斷繁殖后,將叢生芽在無菌條件下分割成單株,每個(gè)單株保證帶有根原基。將分割后的單株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中,給予1500~2000Lux的光照,每天光照時(shí)間為10小時(shí),培養(yǎng)溫度 20~25℃,培養(yǎng) 20~25 天[9]。

    生根培養(yǎng)基:1/2MS+IBA+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L、1/2MS+NAA+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L。

    進(jìn)行不同激素濃度生根培養(yǎng)基生根率對比試驗(yàn),結(jié)果見表3。

    表3 不同激素濃度生根培養(yǎng)基生根率

    1.2.5 試管苗移栽

    將已生根的試管苗在培養(yǎng)的試管中不開口移到自然光照下鍛煉5~6天,然后打開棉塞開口煉苗1~2天,再移栽到移栽基質(zhì)中,移栽基質(zhì)為1:1的腐殖質(zhì)和苔蘚混合物。移栽后5~7天內(nèi)保證 85%~90%的空氣濕度,幼苗管理的生長溫度是20~24℃。直到幼苗緩苗成活,完成了盤龍參組織培養(yǎng)繁殖全過程。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同消毒劑及消毒時(shí)間處理外植體消毒對比試驗(yàn)結(jié)果

    10%(體積)的次氯酸鈉作消毒劑消毒效果不好,不能作為盤龍參組織培養(yǎng)外植體消毒劑。

    用自來水沖洗5~10分鐘,用75%(體積)的酒精浸泡1分鐘,再用0.1%(質(zhì)量)的氯化汞浸泡4分鐘,無菌水沖洗3~5次,外植體消毒效果最好。污染率最低,成活率最高。

    2.2 繼代增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

    通過對不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)增殖對比試驗(yàn),得出:增殖培養(yǎng)基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂粉6.8g/L表現(xiàn)最好,同時(shí)在繼代增殖培養(yǎng)過程中(接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后)進(jìn)行紅光照射10~15天,光強(qiáng)1000~1500Lux的光照,每天光照時(shí)間為16小時(shí),培養(yǎng)溫度24~26℃??商岣咴鲋潮稊?shù),叢生芽增殖了10倍。

    2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

    生根培養(yǎng)基:MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5 g/L,1 500Lux光照,每天光照時(shí)間為10小時(shí),培養(yǎng)溫度20℃,培養(yǎng)20天后叢生芽生根率可達(dá)80%。

    3 結(jié)論

    以盤龍參當(dāng)年生地下隱芽為外植體,用自來水沖洗5分鐘,用75%(體積)的酒精浸泡1分鐘,再用0.1%(質(zhì)量)的氯化汞浸泡4分鐘,無菌水沖洗3~5次,外植體滅菌效果最好,成活率高。

    初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基:改良MS+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L。2 000Lux的光照,每天光照時(shí)間為 12小時(shí),培養(yǎng)溫度22~24℃,培養(yǎng) 20~25 天。

    繼代增殖培養(yǎng)基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L,2500Lux的光照,每天光照時(shí)間為16小時(shí),培養(yǎng)溫度25℃,以40~50天為1個(gè)周期進(jìn)行繼待培養(yǎng)。其間(接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后)進(jìn)行紅光照射10~15天,光強(qiáng)1000~1500Lux的光照,每天光照時(shí)間為16小時(shí),培養(yǎng)溫度24~26℃。

    試管苗生根培養(yǎng)基:MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L,生根率高。

    試管苗移栽基質(zhì)1:1的腐殖質(zhì)和苔蘚混合物。

    通過上述試驗(yàn)方法,經(jīng)過初代、繼代增殖、生根培養(yǎng)、移栽,可實(shí)現(xiàn)盤龍參地下芽隱組織培養(yǎng)繁殖。本方法簡捷,經(jīng)濟(jì)實(shí)用,可操作性強(qiáng),達(dá)到了快繁的目的,可用于蘭科植物盤龍參的工廠化育苗。盤龍參人工組織培養(yǎng)技術(shù)的研究成功,可為黑龍江省大興安嶺地區(qū)野生資源的開發(fā)利用提供技術(shù)保障。

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