正交優(yōu)化超聲輔助法提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究

趙夢瑤，張文杰，張立攀，王法云，陳儉春

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450000）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）屬杜仲科落葉喬木，又名木棉、思仲。其入藥在中國有著悠久的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《名醫(yī)別錄》中對其藥用功能都有相應(yīng)的描述。傳統(tǒng)上杜仲樹皮入藥，由于產(chǎn)量等原因局限性很大。近年來研究表明杜仲葉藥用成分與杜仲皮基本相同、藥用功能相近，且杜仲葉價格低廉，產(chǎn)量較高[1]。杜仲葉主要有效成分為綠原酸，是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，葉中含量可達1%～5%，十分豐富[2-4]。綠原酸具有降血壓、增高白血球、抗菌、抗病毒和腫瘤、增強免疫力，清除體內(nèi)自由基等功效[5-8]。除了醫(yī)藥領(lǐng)域，綠原酸還可應(yīng)用于食品、日用化工領(lǐng)域[9-10]。對綠原酸的研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)，有著良好的前景[11]。

超聲波技術(shù)對植物有效成分提取有著提取得率高、提取速度快的優(yōu)點，超聲波本身的破碎作用使樣品顆粒減小，表面積增大；同時超聲波的空化作用使固液表面的接觸更加充分，增大了接觸面積，從而加快提取速度[12]。本文應(yīng)用超聲波輔助技術(shù)對杜仲葉中的綠原酸進行提取，以綠原酸的得率為考量指標(biāo)，分別進行單因素和正交試驗，對從杜仲葉提取綠原酸的工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

杜仲葉：湖南省邵陽市；綠原酸標(biāo)準品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、鹽酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；QJ-08B粉碎機：上海兆申科技有限公司；60目標(biāo)準型分樣篩：上虞市五四儀器廠；DHG-9052A型臺式電熱干燥箱：上海捷呈實驗儀器有限公司；KQ-700DE型超聲波發(fā)生器：上海昆山儀器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；RE-2000A快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海科升儀器有限公司；UV-8000ST雙光束紫外可見分光：上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

杜仲葉自然風(fēng)干后，置于電熱干燥烘箱中，于50℃烘6 h，之后再于80℃烘3 h；用粉碎機將烘干的樣品磨碎后過60目標(biāo)準分樣篩，篩過的葉粉在烘箱中50℃烘3 h。

1.2.2 杜仲葉中綠原酸的超聲波輔助提取工藝

稱取設(shè)定質(zhì)量的杜仲葉粉，加入到設(shè)定濃度和體積的溶劑中，按照設(shè)定的超聲浸提時間、超聲浸提溫度和超聲浸提次數(shù)進行提取。提取物經(jīng)過濾，少量溶劑潤洗濾渣；所有濾液合并，旋干溶劑，用70%乙醇復(fù)溶，并定容至100 mL容量瓶中，為樣品待測儲備液備用。

1.2.3 綠原酸含量的測定

1.2.3.1 標(biāo)準曲線的繪制

根據(jù)文獻[3]中方法測定綠原酸的標(biāo)準曲線：y=54.153x-0.005，R2=0.999 8。標(biāo)準曲線如圖1所示。

1.2.3.2 綠原酸含量的測定

統(tǒng)一設(shè)定預(yù)處理杜仲葉粉的秤取重量為1.00 g，以保持樣品待測儲備液的移取量為1.00 mL，定容至50 mL，按照文獻[3]中的操作方法進行測定。

根據(jù)公式（1）計算不同試驗組杜仲葉提取物綠原酸得率。

圖1 綠原酸標(biāo)準曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

式中：W為綠原酸得率，%；c為測定液中綠原酸的濃度，mg/mL；m為稱取的杜仲葉樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 杜仲葉綠原酸超聲波輔助提取單因素試驗

1.2.4.1 溶劑pH值的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取50℃，超聲浸提時間取30 min，溶劑pH 值取 3、4、4.5、5、5.5、6 分別進行試驗。研究超聲溶劑不同pH值與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.4.2 超聲浸提溫度的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，超聲浸提時間取30 min，料液比取 1∶20（g/mL），超聲浸提次數(shù)取1次，超聲浸提溫度分別取30、40、50、60、70℃，進行提取試驗。研究不同超聲浸提溫度與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.4.3 溶劑中乙醇濃度的影響

取超聲浸提溫度恒定40℃，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提時間取30 min，超聲浸提次數(shù)取1次，溶劑中乙醇濃度分別取30%、40%、50%、60%、70%和80%，進行提取試驗。研究不同溶劑中乙醇濃度與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.4.4 超聲浸提時間的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提次數(shù)取 1 次，超聲浸提時間分別取 5、10、20、30、40、50、60 min，進行提取試驗。研究不同超聲浸提時間與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.4.5 料液比的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，超聲浸提時間取20 min，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提次數(shù)取1次，料液比分別取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL），進行提取試驗。研究不同料液比與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.4.6 超聲浸提次數(shù)的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶30（g/mL），超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時間取 20 min，超聲浸提次數(shù)取1、2、3、4、5分別進行試驗。研究不同超聲浸提次數(shù)與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢。

1.2.5 杜仲葉綠原酸超聲波輔助提取的正交試驗

通過對單因素試驗結(jié)果的分析，得知超聲浸提次數(shù)和超聲料液比對提取物得率的影響較小，故選擇影響因素較大的溶劑pH值、超聲浸提溫度、溶劑中乙醇濃度和超聲浸提時間進行正交試驗。設(shè)計的因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溶劑pH值的影響

溶劑pH值與杜仲葉綠原酸得率的變化關(guān)系見圖2。

圖2 溶劑pH值與杜仲葉綠原酸得率的變化關(guān)系Fig.2 Effect of pH on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

根據(jù)圖2可得到，在設(shè)定的溶劑pH值范圍內(nèi)，得率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，且當(dāng)pH值為4.5時，得率最大。因為綠原酸是有機酸，容易在相對堿性的環(huán)境下發(fā)生水解，所以在酸性介質(zhì)中較穩(wěn)定，對綠原酸的提取在微酸性溶劑中更好[13]；但是酸性過大，其他雜質(zhì)有機鹽就會被酸化而溶出，從而影響綠原酸的提取得率。由試驗結(jié)果選擇溶劑pH值為4.5左右。

2.1.2 超聲浸提溫度的影響

超聲浸提溫度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見圖3。

圖3 超聲浸提溫度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖3可知，在設(shè)定的超聲浸提溫度范圍內(nèi)，得率先上升，當(dāng)溫度高于40℃后得率呈現(xiàn)出下降的趨勢。這是因為綠原酸為熱敏性物質(zhì)，溫度過高可能造成綠原酸分解，同時也會使得溶劑中的乙醇揮發(fā)變多，從而降低了得率[14]。故選擇超聲浸提溫度40℃左右。

2.1.3 溶劑中乙醇濃度的影響

溶劑中乙醇濃度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見圖4。

圖4 溶劑中乙醇濃度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖4可知，隨著溶劑中乙醇濃度的增加，得率先升高，在乙醇濃度達到70%時開始下降。這可能是因為高于此濃度時，杜仲葉中某些脂溶性物質(zhì)溶出增加，造成提取溶劑的選擇性降低[15]，對綠原酸的提取造成影響，同時濃度較大時，溶劑中乙醇揮發(fā)較快，也會造成綠原酸的提取得率降低。故選取溶劑中乙醇濃度為70%左右。

2.1.4 超聲浸提時間的影響

超聲浸提時間與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見圖5。

圖5 超聲浸提時間與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖5可知，按照設(shè)定的超聲浸提時間范圍，提取物得率迅速升高，在達到20 min以后基本保持穩(wěn)定。這可能是在超聲波作用下，綠原酸在溶劑中達到了溶解平衡。同時，隨著時間的延長，溶劑的逸失也會增加。故選擇超聲浸提時間20 min左右。

2.1.5 料液比的影響

料液比與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見圖6。

圖6 料液比與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖6可知，在設(shè)定的料液比范圍內(nèi)，綠原酸得率隨著溶劑量的增加而逐漸增大，當(dāng)料液比達到1∶30（g/mL）后，繼續(xù)增加溶劑，綠原酸得率趨于穩(wěn)定并略有下降。增加溶劑，化合物分子傳質(zhì)到溶液中的總量增多，當(dāng)杜仲葉中的綠原酸全被溶出后，繼續(xù)增加溶劑，綠原酸的量不會再繼續(xù)上升，繼續(xù)增加溶劑量反而使醇溶性蛋白質(zhì)、黏液、樹脂、鞣質(zhì)、色素、油脂等雜質(zhì)析出量逐漸增加[16]。同時，料液比太大，會增加生產(chǎn)成本，給后處理工序增加困難，所以在保證提取效果的同時，盡量減少溶劑用量[13]。故選擇料液比為1 ∶30（g/mL）左右。

2.1.6 超聲浸提次數(shù)的影響

浸提次數(shù)與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見圖7。

圖7 浸提次數(shù)與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.7 Effect of extraction times on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖7可知，當(dāng)浸提次數(shù)為2時，綠原酸的得率明顯升高，但當(dāng)浸提次數(shù)繼續(xù)增加后，得率基本趨于穩(wěn)定。浸提次數(shù)太多，其他雜質(zhì)的溶出相應(yīng)增加；同時，會使生產(chǎn)周期延長，導(dǎo)致能耗升高，成本增加。故選擇浸提次數(shù)為2。

2.2 杜仲葉綠原酸提取的正交試驗

根據(jù)因素水平表，并按照試驗中提取的操作步驟進行正交試驗分析結(jié)果如表2所示。

表2 正交結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Variance Analysis of orthogonal test method

根據(jù)表2和表3的結(jié)果，可以得出：對杜仲葉中提取物綠原酸得率影響，在各個因素條件中，溶劑pH值和溶劑中乙醇濃度具有顯著性，且溶劑中乙醇濃度的顯著性較大；各因素條件的影響大小依次為：溶劑中乙醇濃度＞溶劑pH值＞超聲浸提溫度＞超聲浸提時間。說明溶劑中乙醇濃度在超聲輔助提取杜仲葉綠原酸的過程中起著首要作用。正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D2，即溶劑中溶劑pH值為4.5，乙醇濃度取70%，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時間取25 min，為驗證正交設(shè)計試驗的結(jié)果，在最優(yōu)條件下，5次平行驗證試驗提取物綠原酸的得率平均值達到4.06%。

3 結(jié)論

首先設(shè)計單因素試驗，研究了各個因素條件與提取物綠原酸得率的相互變化關(guān)系與趨勢；并在此基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計優(yōu)化試驗得到最優(yōu)工藝為溶劑中溶劑pH值為4.5，乙醇濃度取70%，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時間取25 min，在此條件下，綠原酸的得率平均值達到4.06%。結(jié)果表明采用超聲波輔助技術(shù)對杜仲葉中綠原酸進行提取是可行的，得率較高，這為綠原酸的提取純化工藝提供了參考，也為綠原酸相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。