茯磚茶中金花菌菌落計(jì)數(shù)方法的優(yōu)化

劉凱利，黃亞亞，萬(wàn)斌，梁艷，胡歆，*，紀(jì)曉明

（1.咸陽(yáng)涇渭茯茶有限公司，陜西咸陽(yáng)712044；2.陜西蒼山秦茶集團(tuán)有限公司，陜西西安710003）

茯磚茶內(nèi)部或表面存在大量金黃色顆粒狀物質(zhì)，俗稱(chēng)“金花”；其數(shù)量的多少是判斷茯磚茶品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)[1]。由于地域的差異性，金花菌具有多樣性[2-4]，但大都以冠突散囊菌為主，還包括謝瓦式散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、間型散囊菌及肋狀散囊菌等。其子囊果均為閉囊殼型[5]，他們的共同特征是[6]：培養(yǎng)前期（5 d～6 d），菌落質(zhì)地緊密，中心顏色為黃色或棕褐色，周邊為淺黃色。目前，對(duì)金花菌的檢測(cè)一般均采用GB/T 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，該方法針對(duì)的是食品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)，而金花菌閉囊殼很難破裂[7-9]，形成的菌落可能是2個(gè)～3個(gè)或更多個(gè)孢子生長(zhǎng)發(fā)育而成，因此采用國(guó)標(biāo)方法并不能準(zhǔn)確地反映茯磚茶中金花菌的數(shù)量。本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法建立多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，充分考慮各因素之間的影響，通過(guò)前處理?xiàng)l件使金花菌閉囊殼充分破裂釋放子囊孢子，從而得到金花菌菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的優(yōu)化條件，為以后建立茯磚茶中金花菌標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

原料：茯磚茶，由咸陽(yáng)涇渭茯茶有限公司提供。

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸氣滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID單人單面凈化工作臺(tái)：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；GHP-90隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；HZQ-C雙層空氣浴振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基，按GB/T 4789.15-2016配制。

1.2 方法

1.2.1 樣品的準(zhǔn)備

采用GB/T 8302-2013《茶取樣》方法取樣。將整塊茶磚撬碎混勻，取部分混勻茶樣粉碎后備用，部分不粉碎茶樣作為對(duì)照樣品。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù)方法

采用GB/T 4789.15-2016方法。取已準(zhǔn)備好的茶樣25.00 g于裝有無(wú)菌稀釋液的三角瓶中（內(nèi)含200顆玻璃珠[10]），經(jīng)振搖后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)霞永t培養(yǎng)基傾注平板，平板于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第5天計(jì)數(shù)并拍照記錄。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 篩子目數(shù)對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

茶樣粉碎，分別過(guò)篩 40、50、60、70、80、90 目，分別稱(chēng)取過(guò)篩后的茶樣25.00 g于無(wú)菌蒸餾水中，振搖30 min（200 r/min）后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)霞永t培養(yǎng)基傾注平板，（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第5天計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 無(wú)菌稀釋液濃度對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

稱(chēng)取過(guò)篩60目的茶樣25.00 g，分別加入無(wú)菌的蒸餾水、0.45%NaCl、0.85%NaCl、1.25%NaCl、1.65%NaCl、磷酸緩沖溶液中稀釋?zhuān)駬u 30 min（200 r/min）后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)霞永t培養(yǎng)基傾注平板，（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第5天計(jì)數(shù)。

1.2.3.3 振搖時(shí)間對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

稱(chēng)取過(guò)篩60目的茶樣25.00 g于無(wú)菌蒸餾水中，在轉(zhuǎn)速為 200 r/min 條件下，分別振搖 20、30、40、50、60、70 min后，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)霞永t培養(yǎng)基傾注平板，（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第5天計(jì)數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以篩子目數(shù)、NaCl濃度、振搖時(shí)間為自變量，以金花菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，中心試驗(yàn)重復(fù)5次，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 篩子目數(shù)對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

篩子目數(shù)對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 篩子目數(shù)對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響Fig.1 Influence of mesh size on the total number of Jinhua fungus

由圖1可知，篩子目數(shù)對(duì)金花菌菌落總數(shù)影響顯著。隨著篩子目數(shù)的減小，金花菌菌落總數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，篩子目數(shù)從40目至80目，金花菌菌落總數(shù)呈直線(xiàn)增長(zhǎng)，篩子目數(shù)為80目時(shí)，其菌落總數(shù)為（45.8±1.5）×105CFU/g；80目至90目，金花菌菌落總數(shù)趨于平緩，原因可能是高速粉碎機(jī)在粉碎過(guò)程中高速撞擊并產(chǎn)生熱量，當(dāng)粉碎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)容易導(dǎo)致金花菌孢子結(jié)構(gòu)被破壞而失活。因此，篩子目數(shù)選用80目。

2.1.2 無(wú)菌稀釋液濃度對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

無(wú)菌稀釋液濃度對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 無(wú)菌稀釋液對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響Fig.2 Influence of sterile diluent on the total number of Jinhua fungus

由圖2可知，磷酸緩沖溶液對(duì)金花菌孢子釋放作用不明顯，數(shù)量?jī)H為（18.0±1.0）×105CFU/g。當(dāng)稀釋液中NaCl濃度為0.85%時(shí)，金花菌菌落總數(shù)最多，為（35.0±0.8）×105CFU/g。當(dāng)滲透壓過(guò)低時(shí)，過(guò)多的水分進(jìn)入孢子，會(huì)使孢子膨脹或破裂而失活；當(dāng)滲透壓過(guò)高時(shí)，孢子失水收縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)容易被破壞而失活。因此，無(wú)菌稀釋液以0.85%NaCl溶液為宜。

2.1.3 振搖時(shí)間對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響

振搖時(shí)間對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 振搖時(shí)間對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響Fig.3 Influence of the shaking time on the total number of Jinhua fungus

金花菌菌落總數(shù)隨振搖時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明物理振搖對(duì)金花菌子囊果破壁也有一定影響。當(dāng)振搖時(shí)間為50 min時(shí)，金花菌菌落總數(shù)為（36.9±0.8）×105CFU/g；振搖50 min后金花菌菌落總數(shù)趨于平緩，因此振搖時(shí)間選擇50 min。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以篩子目數(shù)、無(wú)菌稀釋液濃度、振搖時(shí)間為自變量，以金花菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差[11]。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results of response surface

2.2.2 模型建立與回歸方程分析

采用Design-Expert.V8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線(xiàn)性擬合，得到以金花菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=50.42-046A+0.54B+1.78C+0.65AB-0.075AC+2.63BC-8.94A2-10.88B2-14.41C2。對(duì)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 平板計(jì)數(shù)法回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression equation of plate counting method

由表 3可知，模型差異性極顯著（P＜0.000 1），說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合較好，能夠反映金花菌菌落總數(shù)與各因素之間的關(guān)系；失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明其他因素對(duì)試驗(yàn)影響很小，適用于茯磚茶中金花菌菌落計(jì)數(shù)方法的優(yōu)化。

表3中F值的大小可以判斷各因素對(duì)金花菌菌落總數(shù)影響的強(qiáng)弱。各個(gè)因素對(duì)金花菌菌落總數(shù)影響的程度大小的次序?yàn)楹Y子目數(shù)＞NaCl濃度＞振搖時(shí)間，數(shù)學(xué)模型的結(jié)果表明 A、B、C、AB、BC、A2、B2及 C2差異性達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明各考察因素對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響具有交互作用，而不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系?？捎迷摶貧w方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，表明試驗(yàn)所選擇的3個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值的影響已達(dá)99.79%，表示該模型條件能夠很好地反映實(shí)際值。其他影響因素對(duì)菌落總數(shù)的影響可忽略不計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)處理?xiàng)l件為：篩子目數(shù)79.74目、NaCl濃度0.86%、振蕩時(shí)間50.49 min，模型預(yù)測(cè)的最佳菌落數(shù)為50.49×105CFU/g。

2.2.3 各因素之間的響應(yīng)面結(jié)果分析

各因素交互作用對(duì)金花菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)金花菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the total number of Jinhua fungus

響應(yīng)面三維圖中曲面的陡峭程度可以表明自變量對(duì)金花菌菌落總數(shù)的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較?。欢雀呔€(xiàn)圖反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[12]。結(jié)合本研究中的二次回歸方程及表3可知，二次項(xiàng)AB、BC具有極顯著的交互作用（P＜0.01），即篩子目數(shù)與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時(shí)間每?jī)蓚€(gè)因素間均具有顯著的交互作用。由圖4可知篩子目數(shù)與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時(shí)間、篩子目數(shù)與振搖時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)的影響先升高后降低，響應(yīng)值呈拋物線(xiàn)形趨勢(shì)，因此回歸方程有極大值。

2.2.4 模型的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可靠性，本研究按照模型得到的金花菌菌落總數(shù)最佳計(jì)數(shù)條件進(jìn)行試驗(yàn)操作驗(yàn)證，結(jié)合試驗(yàn)的可行性，得到最終優(yōu)化條件為篩子目數(shù)80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液、振搖時(shí)間50 min，平行6次試驗(yàn)，得到金花菌菌落總數(shù)為（50.75±1.1）×105CFU/g，與模型預(yù)測(cè)的數(shù)值進(jìn)行比較分析，菌落數(shù)的RSD值為1.1%，其RSD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于3%，因此，可以選擇以上條件作為茯磚茶中金花菌菌落總數(shù)的最佳優(yōu)化參數(shù)。

2.3 方法驗(yàn)證

采用上述優(yōu)化方法與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行金花菌菌落總數(shù)的對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 國(guó)標(biāo)方法和優(yōu)化方法對(duì)不同茯磚茶的計(jì)數(shù)結(jié)果Table 4 Counting results of different Fu brick tea by GB method and optimization method

結(jié)果顯示，優(yōu)化方法得到的金花菌菌落總數(shù)是國(guó)標(biāo)方法的5倍左右。

3 結(jié)論

目前關(guān)于金花菌菌落計(jì)數(shù)方法及破壁方法的研究較少，本研究在國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，取樣時(shí)將整塊茶磚撬碎混勻，茶樣粉碎過(guò)篩80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液，振搖時(shí)間50min（轉(zhuǎn)速為200 r/min），該條件下，優(yōu)化方法得到的金花菌菌落總數(shù)均在107CFU/g以上，相比國(guó)標(biāo)方法提高了5倍左右，優(yōu)化效果明顯，為確定金花菌標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法提供了試驗(yàn)依據(jù)。