高通量測序技術(shù)在食源性病原體快速檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

付博菲，朱曉龍，邱斌

（1.天津師范大學(xué)，天津300387；2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

近20年來，隨著食源性疾病發(fā)生率明顯升高，其 已成為嚴(yán)重危害公眾健康的全球性問題[1]。其中，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最重要的因素之一[2]，在我國食物中毒事件中，沙門氏菌、副溶血性弧菌等微生物性食物中毒事件最多。這些直接（感染性抗原）或間接（代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌毒素、真菌毒素）造成食源性疾?。╢oodborne diseases，F(xiàn)BDs）的微生物則稱之為食源性病原體（foodbornepathogens，F(xiàn)BPs）[3-4]。常見的FBPs包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲和部分真菌。無論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，F(xiàn)BPs都可能對(duì)食品安全及公眾健康帶來嚴(yán)重威脅[5-7]。

食源性病原體引發(fā)食物中毒爆發(fā)后的調(diào)查、確診、控制、監(jiān)測，均需要病原微生物分析，目前常用的方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)以及分子生物學(xué)、免疫學(xué)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。傳統(tǒng)的培養(yǎng)需要大量時(shí)間和人力通過富集、分離以獲取純種病原體，ELISA技術(shù)敏感性低、易出現(xiàn)假陽性且操作前需富集等缺點(diǎn)[8]，PCR技術(shù)雖然精度高、速度快，但花費(fèi)高，且通量低致使操作繁瑣重復(fù)[9]，高通量測序技術(shù)（high throughput sequencing，HTS）由于其通量大正在逐步應(yīng)用于FBPs的檢測。

高通量測序技術(shù)可以快速獲取被檢測樣本成千上萬的基因序列或者是數(shù)以億計(jì)的堿基對(duì)信息。讀取的序列長度、錯(cuò)讀率及讀取數(shù)目變化大，并可根據(jù)實(shí)際選用選擇性、非選擇性、隨機(jī)性等模式。其數(shù)據(jù)庫涵蓋了絕大多數(shù)的致病微生物的高質(zhì)量基因組，且數(shù)目仍在快速增長。即使在遇到無法識(shí)別的基因組時(shí)，也可在半自動(dòng)化的de novo測序及基因重組技術(shù)的輔助下實(shí)現(xiàn)鑒別[10]。目前，包含上千個(gè)完整序列基因組的數(shù)據(jù)庫已投入使用，使常見的乃至是罕見的病原微生物的鑒別變得更加迅速。通常來說，低錯(cuò)讀率，長讀取，高覆蓋率有利于序列重組。但在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)目的基因組的讀取長度、數(shù)目、錯(cuò)讀率及花費(fèi)來綜合衡量，選取合適的HTS平臺(tái)。

1 基于HTS的食源性微生物分析

高通量測序技術(shù)由于其無需培養(yǎng)、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)逐步成為食品檢測的常規(guī)途徑。其主要操作流程包括提取樣品中微生物總DNA或RNA、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增、基因組測序及基于數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析。根據(jù)是否檢測樣品全部基因組分為全基因測序（whole genome sequencing，WGS）及靶基因組測序。Marchesi等將靶基因組測序，即對(duì)多種RNA編碼性DNA或其他標(biāo)志性DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增分析稱之為“Metataxonomics”[11]。全基因組測序可檢測樣品中的全部DNA序列?；谌蚪M的或全轉(zhuǎn)錄的RNA測序則統(tǒng)稱為RNA測序。全基因組測序具有誤差小、無需預(yù)知特異性標(biāo)志基因組及可用來檢測微生物基因組組成變化等優(yōu)點(diǎn)，但花費(fèi)高、數(shù)據(jù)復(fù)雜且量大，相對(duì)來說Metataxonomics則具有敏感度高，費(fèi)用少，但在檢測相似菌種的時(shí)候難以區(qū)分。因此在應(yīng)用HTS時(shí)應(yīng)根據(jù)具體目的選擇合適的模式。

目前應(yīng)用較廣泛的HTS測序技術(shù)有Illuminag公司的Solexa測序技術(shù)、Roche公司的454焦磷酸技術(shù)、ABI公司的SOLID序技術(shù)及Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)。Solexa測序是目前流行的HTS技術(shù)，其利用“DNA簇”技術(shù)可在DNA片段合成同時(shí)測序，并將脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）可逆性終止技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用相應(yīng)的激光捕獲裝置獲取在激光激發(fā)條件下樣本的熒光信號(hào)，確保實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的檢測基因序列組成，該技術(shù)具有保真度最高，測序周期短，具有GA、Hiseq、Miseq、NextSeq 等多系列測序儀器。454焦磷酸技術(shù)測序起始時(shí)T、A、C、G 4種堿基依次進(jìn)入含有多種誘發(fā)焦磷酸發(fā)生反光反應(yīng)所必需的酶及底物的顯微滴定板（pico titer plate，PTP）中，當(dāng)發(fā)生堿基配對(duì)后，釋放出的焦磷酸則會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng)，釋放出可經(jīng)電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）捕捉的光信號(hào)。相對(duì)Sanger法測序速度、準(zhǔn)確性及樣本量均大大提高，但由于產(chǎn)生同聚物而存在誤差，其錯(cuò)讀率則相對(duì)較高[12]，多用于宏基因組測序。ABI SOLID測序技術(shù)則是直接以4色熒光標(biāo)記的4種堿基，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)后比較分析顏色編碼序列。其突出特點(diǎn)為每個(gè)堿基可被檢測2次，提高讀取序列結(jié)果的準(zhǔn)確性，且相關(guān)磁珠編碼系統(tǒng)相對(duì)完善，適用于檢驗(yàn)單核苷酸多態(tài)性[13]，在實(shí)驗(yàn)或食品微生物檢測應(yīng)用中潛力巨大。而（switching mechanism at 5′end of the RNA tran，SMRT）技術(shù)由于其具有單分子實(shí)時(shí)測序功能，且讀取基因組長度明顯高于第二代測序技術(shù)[14]，其突出優(yōu)點(diǎn)為樣品需要量小，讀取速度快，提供信息量較第二代測序技術(shù)大，可檢測到如甲基化等堿基修飾改變，多用于完全性封閉基因組、長鏈重復(fù)性序列、質(zhì)粒及噬菌體的重組。

在食源性微生物的研究中，HTS有助于全面了解食品中微生物群落、動(dòng)態(tài)和生理活性，CJ Doyle等人利用HTS通過檢測微生物變化反映原生乳的泌乳階段及保存條件[15]，其所需時(shí)間僅為 2 d～3 d，此外，HTS還可檢測乳制品中微生物的多樣性[16]，由此可見HTS可快速檢測食品質(zhì)量、保證食品安全。

2 HTS在食源性病原體檢測中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌性食源性病原體

細(xì)菌性FBPs在食品中具有含量少、傳播快的特點(diǎn)。因此具有檢測多種食物來源的超低水平的FBP能力至關(guān)重要。目前常用的檢測方法是富集、提純?nèi)缓髴?yīng)用PCR技術(shù)檢測。但從食物中分離致病菌十分困難。食品中最為普遍的細(xì)菌性病原體為沙門氏菌、李斯特菌和產(chǎn)毒性大腸桿菌，這3種細(xì)菌常誘發(fā)危及生命或嚴(yán)重的食源性疾病[17-18]，因此在食品檢測或食源性疾病致病菌診斷中，以這3種細(xì)菌為主。

WGS可通過單核苷酸分析或擴(kuò)增性多位點(diǎn)序列分型對(duì)菌群亞型實(shí)現(xiàn)精確分類，并可協(xié)助毒性及抗生素抗性基因等組分的鑒別[19-21]。Underwood等選取一項(xiàng)早期STEC O157：H7爆發(fā)研究中患者及動(dòng)物的提取物利用WGS進(jìn)行比較及致病菌鑒別，根據(jù)測序結(jié)果將其分為5個(gè)亞型。后將這些數(shù)據(jù)應(yīng)用于跟蹤疫情，在對(duì)疫區(qū)其他106份提取物的檢測中發(fā)現(xiàn)，證明這5種亞型致病菌在感染人類前廣泛地分布在該農(nóng)場區(qū)域[22]。這提示W(wǎng)GS對(duì)于食源性疾病的流行監(jiān)控及致病菌追蹤具有重要意義。Gilmour等則運(yùn)用該技術(shù)成功鑒別2008年加拿大的食源性疾病爆發(fā)的致病菌為李斯特菌[23]。近年來在芯片技術(shù)的輔助下，高通量測序有了進(jìn)一步發(fā)展。郭啟新等則運(yùn)用高通量技術(shù)及液相芯片技術(shù)建立了檢測金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的方法，具有高特異性及高靈敏度[24]。Sun等建立的高通量懸浮陣列可同時(shí)檢測6種食源性致病菌，且靈敏度高達(dá)20.4×103CFU/mL[25]，這提示應(yīng)用HTS進(jìn)行多樣品多菌種的同時(shí)檢測將逐步成為現(xiàn)實(shí)。

但在多數(shù)情況下，食物中聚集含量很低，獲得目標(biāo)病原菌的提取物十分困難。病原體通常是分散的且在復(fù)雜的食物微生物群落中占比很少。因此，通過對(duì)目的基因及其他多種序列保守的標(biāo)志物進(jìn)行檢測分析的Metataxonomics技術(shù)則為無法選擇性提取的微生物（包括無法培養(yǎng)和可培養(yǎng)但無法傳代的微生物）檢測提供了可能。在對(duì)2011年德國STEC O104：H4的回顧性研究中已證實(shí)Metataxonomics也可應(yīng)用于食源性疾病爆發(fā)后病原體的鑒別[26]，經(jīng)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)65%的基因與大腸桿菌相關(guān)。在對(duì)其他樣本檢測中還鑒別出彎曲桿菌、沙門氏菌和梭狀芽胞桿菌等人類致病菌。Metataxonomics同時(shí)也應(yīng)用于食品監(jiān)測，如沙門氏菌污染的番茄已造成多次食源性疾病爆發(fā)，但從番茄中提取沙門氏菌只成功了幾次，Ottesen等利用MiSeq DNA測序及Metataxonomics技術(shù)成功從番茄樣本中鑒別出沙門氏菌[27]。后來測序與Metataxonomics相結(jié)合的方法逐步應(yīng)用于冰淇淋中李斯特菌、菠菜中大腸桿菌的檢測[28-29]。FF De等則利用454平臺(tái)檢測奶酪制品中的嗜熱鏈球菌lacS基因，發(fā)現(xiàn)不同樣品中含有28種lacS基因型[30]，為將非rRNA基因標(biāo)志應(yīng)用于細(xì)菌定量檢測提供了先例。芬蘭學(xué)者M(jìn) Andreevskaya運(yùn)用SOLID測序技術(shù)對(duì)魚乳球菌Lactococcus piscium MKFS47進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其腐敗功能與異常的丙酮酸代謝途徑相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌的特有基因，為以后該菌的檢測提供了特異性識(shí)別基因[31]。此外，由于HTS的高通量特性，也常用來分析食品中微生物群落的變化情況，對(duì)于抑制食品中有害微生物滋生、延長食品保質(zhì)期提供參考。Ercolini D等通過對(duì)存儲(chǔ)在空氣、真空和抗菌包裝中的牛肉在保存過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝物進(jìn)行全程監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)不同條件下致腐微生物的差異，從而提出既有針對(duì)性的牛肉的保鮮建議[32]。HTS無需培養(yǎng)、直接、快速檢測的優(yōu)點(diǎn)推動(dòng)了其在食品微生物的監(jiān)控中的應(yīng)用，而簡化快捷的檢測方法的應(yīng)用間接促進(jìn)了國際食品貿(mào)易的發(fā)展。

由此可見，HTS技術(shù)無論是在調(diào)查爆發(fā)性食源性疾病致病菌還是在易污染食品的易感菌的檢測上都有著巨大潛力。目前，大多數(shù)的食源性致病菌甚至是非致病的基因組數(shù)據(jù)庫均已建立，并且細(xì)菌分類相關(guān)的特異性基因組數(shù)據(jù)也在快速增加，促進(jìn)HTS可分析鑒別的致病菌種類大幅增長，HTS將越來越普遍的應(yīng)用于食源性致病菌的鑒別、食品快速檢測及疾病控制中。

2.2 病毒性食源性病原體

病毒性FBP基因組相對(duì)于細(xì)菌性FBP簡單，缺少編碼轉(zhuǎn)錄蛋白的DNA以及復(fù)制、繁殖相關(guān)基因，且具有高度多樣化，沒有如同細(xì)菌中核糖體RNA的共有基因結(jié)構(gòu)[33]。病毒性FBP在FBD中具有雙重作用，一方面可以影響食品中細(xì)菌的毒性及群落構(gòu)成，另一方面可直接誘發(fā)FBD[34-35]。由于正常的烹飪即可消滅病毒，所以引起病毒感染的食物通常是新鮮的農(nóng)產(chǎn)品，如軟漿果，草本植物，貝類，即食產(chǎn)品或其他生食。常見的FBP病毒有諾如病毒、甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒、單鏈RNA病毒及輪狀病毒。由于病毒性FBP除通過食物傳播外，還可通過人與人之間傳播，更易誘發(fā)集中性大規(guī)模爆發(fā)。甲型肝炎常爆發(fā)于衛(wèi)生條件好且無廣泛接種疫苗的地區(qū)，如最近的報(bào)道的歐洲HAV疫情，造成1 589人感染，2人死亡[36]。我國突發(fā)公共衛(wèi)生事件評(píng)估顯示諾如病毒為病毒性腹瀉主要致病原[37]，在北京地區(qū)對(duì)市售牡蠣輪狀病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)有引發(fā)食源性疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)[38]。這提示我們即使在衛(wèi)生條件良好的城市也不可放松對(duì)食源性疾病的重視。及時(shí)監(jiān)測及發(fā)現(xiàn)銷售食品中的病毒性FBP對(duì)于防范FBD、維護(hù)食品安全、保障公眾健康具有重要意義。

盡管部分病毒可培養(yǎng)，但其設(shè)備要求高、花費(fèi)多且耗時(shí)長，所以目前常用的檢測方法中無需培養(yǎng)。HTS則為食源性病毒檢測提供了快速便捷且可靠的方法。由于食品中病毒含量低，所以提取物樣品多取自臨床患者，如糞便。在一項(xiàng)美國流行病學(xué)研究中，則發(fā)現(xiàn)甲型肝炎爆發(fā)的病因是進(jìn)口冷凍石榴子受到HAV污染[39]。而Mizukoshi等成功應(yīng)用MiSeq RNA測序診斷出2012年日本青少年胃腸炎爆發(fā)的病原體是G1P[8]型輪狀病毒[40]，但在后來的調(diào)查中，未發(fā)現(xiàn)食物媒介。張靜娜等則利用Hiseq 2500對(duì)丙型肝炎病毒病毒（hepatitis C virus，HCV）Core/E基因高變區(qū)進(jìn)行測序比較，對(duì)共用針具感染乙肝病毒的患者進(jìn)行溯源調(diào)查[41]，這提示HTS應(yīng)用在追蹤食源性感染源頭上具有可行性。HTS也可應(yīng)用于檢測食品中的病毒，諾如病毒具有極強(qiáng)的傳染性，常造成大規(guī)模的胃腸炎流行，致使其成為世界范圍內(nèi)腹瀉相關(guān)疾患的主要原因[42]，也成為美國食源性疾病的主要病因[43]。Imamura等應(yīng)用HiSeq測序儀的RNAseq技術(shù)及MiSeq系統(tǒng)對(duì)衣殼蛋白VP1基因進(jìn)行分型，檢測并分析海岸貝類所感染諾如病毒的基因型差異[44]，AW等建立了應(yīng)用HiSeq鑒別生菜中人畜共患疾病病毒的方法[45]，F(xiàn)ernandez-Cassi等則應(yīng)用MiSeqRNAseq技術(shù)對(duì)經(jīng)污染的水灌溉的荷蘭芹進(jìn)行病毒分析鑒別[46]。我國學(xué)者鄭乾明通過提取可疑感染病毒的火龍果枝條總RNA并合成cDNA，應(yīng)用IlluminaHiseq 4000進(jìn)行測序，成功分析火龍果感染的病毒種類[47]。

病毒性食源性疾病的病原體常無法確診，一方面是由于病毒含量低，檢測技術(shù)的敏感度低，另一方面則是病毒變異多，易出現(xiàn)新型病毒，缺少新病毒相關(guān)的基因組數(shù)據(jù)庫。但是隨著提取、數(shù)據(jù)分析等相關(guān)技術(shù)的完善，以及運(yùn)用de novo重組技術(shù)迅速建立新型病毒的基因組數(shù)據(jù)庫，HTS檢測技術(shù)逐步完善。目前HTS多用于臨床病毒檢測乃至病毒性疾病跨國傳播的防控中，我國已成功應(yīng)用HTS于入境人員相關(guān)病毒疾病的檢測[48]。同時(shí)，HTS加速了病毒遺傳學(xué)、病毒基因組學(xué)和病毒相關(guān)的分子流行病學(xué)，病毒的變異及種特征、疫苗無效的分析乃至病毒藥物抗性的分析幾乎完全依賴于HTS。盡管HTS很少用于病毒性食源性病原體的鑒別，但可以預(yù)見的是HTS在該領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用價(jià)值[49]。

2.3 真菌性及寄生蟲性食源性病原體

目前HTS應(yīng)用于真菌性FBP檢測的案例很少，經(jīng)報(bào)道的食源性真菌感染則更為稀少[50]。代表性的案例為Lee S等從引起爆發(fā)性食源性疾病的酸奶中發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉菌基因組，并確定其為具有高毒性的M.circinelloides f.circinelloides亞型[51]。此外Billmyre等運(yùn)用Hiseq 2500行全基因組測序，追蹤高重組VGII型隱球菌的流行及變異，發(fā)現(xiàn)該類隱球菌可通過有性及無性繁殖實(shí)現(xiàn)基因組不同幅度的進(jìn)化，從而增強(qiáng)感染性及毒性[52]，Sophie Vaux運(yùn)用IlluminaHiSeq 2000對(duì)來自于多個(gè)患者的不同真菌系進(jìn)行測序，后利用Phylogenetic analysis分析比較檢測所得的高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），成功利用WGS與clone-specific genotyping技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新的機(jī)會(huì)性致病真菌[53]。截止至2017年8月，NCBI公布的真菌相關(guān)基因序列只有2 515個(gè)，完整的真菌基因組僅為29個(gè)，且真菌多為機(jī)會(huì)性致病菌，患者多免疫力低下，一定程度上限制了HTS在真菌檢測的應(yīng)用。寄生蟲則是一類體積較小的動(dòng)物或真核生物，多可使用顯微鏡及PCR確診，幾乎不適用HTS，目前僅有一篇相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)，在對(duì)比目魚相關(guān)的食源性疾病的病原調(diào)查中，從魚肉中發(fā)現(xiàn)可疑孢子，推測可能是寄生蟲感染，Kawai等應(yīng)用GAIIRNAseq技術(shù)并輔以Sanger DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)粘孢子蟲（Kudoaseptempunctata）的18S rDNA，結(jié)合后續(xù)的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)，明確Kudoaseptempunctata為該次爆發(fā)食源性疾病的罪魁禍?zhǔn)譡54]。

3 HTS的優(yōu)勢及缺陷

高通量測序技術(shù)相對(duì)于其他技術(shù)具有無需培養(yǎng)、可快速準(zhǔn)確的獲取樣品（食物或其他載體）中多數(shù)微生物的高級(jí)別基因信息，并可以同時(shí)分析單個(gè)或多個(gè)樣品中的多種微生物區(qū)系，且其操作已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或半自動(dòng)化，極大地節(jié)省了人力和物力，理想的HTS技術(shù)應(yīng)該是快速、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)且花費(fèi)低。但目前仍存在不足，例如由于HTS的平臺(tái)少及后續(xù)分析數(shù)據(jù)復(fù)雜且量大及樣本收集、預(yù)處理，造成測序花費(fèi)少，整體花費(fèi)高。且由于測序獲得信息多，其處理需要高效強(qiáng)大的計(jì)算能力，這對(duì)于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、管理、質(zhì)量控制、繪制圖譜及宏基因組學(xué)，乃至是生物信息學(xué)均有著極高的要求[55]。同時(shí)HTS測序平臺(tái)對(duì)于基因組數(shù)據(jù)庫的訪問權(quán)限限制，其高額的訪問費(fèi)用加劇了HTS進(jìn)一步應(yīng)用與推廣的障礙。

4 展望

近年來，HTS被廣泛應(yīng)用于食品微生物研究中，在食源性病原體的檢測中也逐步推廣。不可否認(rèn)的是目前HTS數(shù)據(jù)庫仍缺少很多病原體基因組信息，特別是病原體本身高頻率的變異及新病毒、細(xì)菌種類的出現(xiàn)，致使可鑒別的病原體種類占比更小。但隨著測序技術(shù)的推廣，病原體基因組信息不斷完善，新鑒別基因位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，可充分滿足多數(shù)FBP鑒別檢測要求。此外，也應(yīng)改進(jìn)生物信息學(xué)的存儲(chǔ)、分析、比較方式，提出更高速的計(jì)算方法，并開放基因組信息的數(shù)據(jù)庫訪問權(quán)限，拓寬HTS獲取渠道。未來HTS將與納米檢測技術(shù)等新興方法相聯(lián)合，進(jìn)一步簡化操作程序，提高檢測特異性、敏感性，并降低花費(fèi)，使HTS不僅用于食源性病原體的檢測鑒別，還將具有探究抑制食源性病原體滋生、食品保鮮、病原體群落間作用及其他更為廣泛的應(yīng)用。