長鏈非編碼RNA HOTAIR對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

周越菡， 李曉文， 黃思茂， 龍仕儒， 周燕園

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

HOX反義基因間RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)是定位于人類染色體12q13.13區(qū)域HOX基因家族HOXC11基因的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-5]。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達(dá)的急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者生存率低、預(yù)后差[6]，然而，HOTAIR對(duì)ALL增殖和凋亡的影響仍有待進(jìn)一步研究。

糖皮質(zhì)激素,如地塞米松等是臨床治療ALL的一線藥物，其主要作用通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors，GR)介導(dǎo)，治療ALL的作用機(jī)制是通過與GR結(jié)合并誘導(dǎo)ALL細(xì)胞凋亡。GR若向下調(diào)節(jié)，就會(huì)引發(fā)機(jī)體對(duì)糖皮質(zhì)激素的耐藥性，使預(yù)后變差[7]。因此，本研究擬觀察HOTAIR小干擾RNA (HOTAIR small interfering RNA, si-HOTAIR)對(duì)ALL細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及研究地塞米松對(duì)ALL細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的影響，并通過研究si-HOTAIR對(duì)GR蛋白及其編碼基因的作用，以探討HOTAIR影響ALL細(xì)胞活力及凋亡的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5購自ATCC；人ALL細(xì)胞株MOLT-4、CCRF-CEM和CEM-C1購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素、TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher；5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒和Hoechst 33342購自Sigma-Aldrich；Caspase-Glo?3/7 Assay Kit購自Promega；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；si-HOTAIR套裝合成自廣州銳博生物科技有限公司；PCR引物由Life Technologies合成；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；抗GR抗體購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HS-5、MOLT-4、CCRF-CEM和CEM-C1細(xì)胞均培養(yǎng)于含1%青鏈霉素、10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5% CO2、相對(duì)濕度95%、37 ℃的恒溫密閉式培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書，將si-HOTAIR轉(zhuǎn)染至CEM-C1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，RT-qPCR檢測HOTAIR的沉默效率。si-HOTAIR的正義鏈為5’-CCACAUGAACGCCCAGAGAUU-3’，反義鏈為 5’-AAUCUCUGGGCGUUCAUGUGG-3’；空白對(duì)照siRNA(negative control siRNA,siRNA-NC)的正義鏈為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2.2RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR 總RNA提取按照TRIzol RNA提取試劑說明書進(jìn)行，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列見表1。結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算，ΔCt=目的基因平均Ct值-內(nèi)參照基因平均Ct值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR的引物序列

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96孔板，分別轉(zhuǎn)染si-NC和si-HOTAIR，并于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8。加入CCK-8的細(xì)胞板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)值。si-NC組細(xì)胞存活率(%)=轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)450 nm處A值/si-NC 0 h組450 nm處A值×100%；si-HOTAIR組細(xì)胞存活率(%)=轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)450 nm處A值/si-HOTAIR 0 h組450 nm處A值×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4BrdU法檢測細(xì)胞增殖 選取對(duì)數(shù)生長期的CEM-C1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染si-NC或si-HOTAIR 48 h后，加入50 μmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)，并用相同轉(zhuǎn)染條件的、不加地塞米松處理的等量細(xì)胞作為對(duì)照。加藥后48 h，加入BrdU孵育4 h。然后根據(jù)試劑盒說明書，依次加入預(yù)冷細(xì)胞固定液、核酸酶工作液、抗BrdU-POD Fab片段工作液、工作緩沖液和過氧化物酶底物，測定405 nm處A值。

2.5Hoechst 33324法檢測細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長期的CEM-C1細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)成細(xì)胞懸液，以每孔400 μL、5×107/L的密度接種在24孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染si-HOTAIR及si-NC作用48 h后，用5 mg/L的Hoechst33342染色10 min，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.6Caspase-3/7激活形式檢測 參照Caspase-Glo? 3/7 Assay Kit說明書，選取對(duì)數(shù)生長期CEM-C1細(xì)胞，以每孔104個(gè)的密度接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白反應(yīng)組、陰性對(duì)照組、si-NC組及si-HOTAIR組：空白反應(yīng)組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，用于測量細(xì)胞培養(yǎng)體系和Caspase-Glo? 3/7試劑的螢光背景值；陰性對(duì)照組為不經(jīng)處理的CEM-C1細(xì)胞，用于確定細(xì)胞體系的caspase 3/7基本表達(dá)活性；si-NC組和si-HOTAIR組分別轉(zhuǎn)染si-NC及si-HOTAIR。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。si-NC組和si-HOTAIR組轉(zhuǎn)染48 h后，將培養(yǎng)各組細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板從37 ℃培養(yǎng)箱中取出，平衡至室溫，每孔加入與培養(yǎng)基等體積的Caspase-Glo? 3/7試劑，振蕩30秒混勻后，室溫下避光孵育1 h，然后轉(zhuǎn)移各孔液體至不透明96孔白板中，用Berthold Centro LB 960 微孔板發(fā)光檢測儀讀取各孔的熒光值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。si-NC組、si-HOTAIR組的caspase-3/7活性=(發(fā)光檢測儀測得的實(shí)際數(shù)值-空白反應(yīng)組讀數(shù))/(陰性對(duì)照組讀數(shù)-空白反應(yīng)組讀數(shù))。

2.7Western blot法檢測GR蛋白含量 轉(zhuǎn)染了si-NC和si-HOTAIR的CEM-C1細(xì)胞，離心后棄去上清液，4 ℃ PBS洗 1 遍后，再離心棄去PBS，每組加含62.5 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，2% (W/V) SDS, 10% (V/V) 甘油，50 mmol/L DTT，0.1%溴酚藍(lán)細(xì)胞裂解液100 μL進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，4 ℃下孵育 I 抗過夜后，用HRP-結(jié)合的抗兔IgG的 II 抗和HRP-結(jié)合的抗生素抗體室溫下共同孵育1 h。TBST洗膜，暗室內(nèi)曝光，拍照。以GAPDH作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HOTAIR在人ALL細(xì)胞系與人正常淋巴細(xì)胞系存在差異表達(dá)

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOTAIR的mRNA表達(dá)水平在人ALL細(xì)胞系MOLT-4、CCRF-CEM和CEM-C1明顯高于人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5(P<0.01)，見圖1。因此，選用HOTAIR表達(dá)量最高的CEM-C1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

Figure 1.The expression level of HOTAIR in human normal bone marrow stromal cells and human ALL cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHS-5.

圖1RT-qPCR檢測HOTAIR在人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞與ALL細(xì)胞中的表達(dá)

2 si-HOTAIR在CEM-C1細(xì)胞的沉默效率

將si-HOTAIR及其空白對(duì)照序列si-NC分別轉(zhuǎn)染到CEM-C1細(xì)胞，48 h后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測HORAIR的mRNA表達(dá)量，以驗(yàn)證si-HOTAIR在該細(xì)胞系中的沉默效率。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞HOTAIR的沉默效率為(72.27±4.89)%，較轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照序列si-NC的CEM-C1細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見圖2。因此該si-HOTAIR可用于后續(xù)研究。

Figure 2.The knockdown efficiency of si-HOTAIR determined by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group.

圖2RT-qPCR法檢測si-HOTAIR的沉默效率

3 si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞活力的影響

與轉(zhuǎn)染了si-NC的CEM-C1細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR從而敲減CEM-C1細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)后，CEM-C1細(xì)胞的活力明顯受到抑制(P<0.01)，見圖3，說明HOTAIR會(huì)促進(jìn)ALL細(xì)胞的活力。

Figure 3.The effect of si-HOTAIR on CEM-C1 cell viability. The viability of leukemia cells transfected with si-HOTAIR and negative control siRNA (si-NC) was mea-sured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group at the same time point.

圖3si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞活力的影響

4 si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞增殖的影響及對(duì)地塞米松抑制CEM-C1細(xì)胞增殖的增效作用

與轉(zhuǎn)染了si-NC的CEM-C1細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR從而敲減CEM-C1細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)后，CEM-C1細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(P<0.01)，說明HOTAIR會(huì)促進(jìn)ALL細(xì)胞的增殖。CEM-C1屬糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染si-NC后應(yīng)用50 μmol/L地塞米松處理48 h，與轉(zhuǎn)染si-NC組相比，細(xì)胞增殖率為(87.48±4.24)%;而轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后應(yīng)用相等劑量的Dex，細(xì)胞增殖率降至(39.24±3.26)%，與轉(zhuǎn)染si-NC后應(yīng)用Dex相比對(duì)增殖的抑制顯著增強(qiáng)(P<0.01)，證明si-HOTAIR對(duì)Dex抑制CEM-C1細(xì)胞增殖的效應(yīng)具有增效作用，見圖4。

5 si-HOTAIR對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

用si-HOTAIR敲減CEM-C1細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)后，Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示，CEM-C1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮、碎裂、溶解并出現(xiàn)凋亡小體，呈現(xiàn)體積明顯縮小的深染核形態(tài)；而轉(zhuǎn)染si-NC的CEM-C1細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對(duì)均勻，核無固縮，故在視野中呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)，見圖5。為進(jìn)一步在分子水平闡明其誘導(dǎo)凋亡的作用，本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量檢測si-HOTAIR對(duì)凋亡通路中的關(guān)鍵執(zhí)行分子caspase-3/7活性的影響，si-HOTAIR顯著增強(qiáng)caspase-3/7的活性(P<0.01),見圖6。上述實(shí)驗(yàn)說明抑制HOTAIR的表達(dá)可誘發(fā)ALL細(xì)胞凋亡。

Figure 4.The effect of si-HOTAIR on CEM-C1 cell proliferation and the influence of si-HOTAIR on the anti-proliferation effect of dexamethasone (Dex). The proliferation of leukemia cells transfected with si-HOTAIR and ne-gative control siRNA (si-NC) was measured by BrdU assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group;▲P<0.05vssi-HOTAIR group;##P<0.05vssi-HOTAIR+Dex group.

圖4si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞增殖的作用及對(duì)Dex抑制CEM-C1細(xì)胞增殖作用的影響

Figure 5.The effect of si-HOTAIR transfection on the CEM-C1 cell apoptosis detected by Hoechst 33342 staining (×100)．

圖5si-HOTAIR轉(zhuǎn)染對(duì)CEM-C1細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Influence of si-HOTAIR on caspase-3/7 activity in CEM-C1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group.

圖6si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞caspase3/7活性的影響

6 si-HOTAIR在蛋白質(zhì)水平與mRNA水平顯著提高GR的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)及其灰度分析結(jié)果證明，與si-NC組相比，si-HOTAIR在蛋白水平顯著提高CEM-C1細(xì)胞的GR表達(dá)(P<0.01),見圖7。RT-qPCR結(jié)果證明，與si-NC組相比，si-HOTAIR在mRNA水平顯著提高CEM-C1細(xì)胞的GR mRNA表達(dá)水平(P<0.01),見圖8。

Figure 7.si-HOTAIR mediated GR expression in CEM-C1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group.

圖7si-HOTAIR對(duì)CEM-C1細(xì)胞GR蛋白水平的影響

Figure 8.Relative mRNA expression of GR in CEM-C1 cells after transfection of si-NC or si-HOTAIR detected by RT-qPCR analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-NC group.

圖8RT-qPCR法檢測si-HOTAIR對(duì)GRmRNA表達(dá)的影響

討 論

ALL是一種白血病細(xì)胞在骨髓及其它造血組織中大量增殖而誘發(fā)的造血干細(xì)胞惡性克隆性血液系統(tǒng)腫瘤，起源于機(jī)體淋巴系祖細(xì)胞惡性突變[8]。近年來，我國ALL的發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢[9]。位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的、轉(zhuǎn)錄本長度在200～100 000 nt之間的lncRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸受到重視[10]。2007年，Rinn等[11]首次報(bào)道lncRNA HOTAIR對(duì)乳腺癌侵襲與遷移的生物學(xué)關(guān)系，陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)異常[12-13]。有研究表明，HOTAIR的高表達(dá)與包括ALL在內(nèi)的多種急性白血病患者的預(yù)后不良有關(guān)[6]，因此，進(jìn)一步研究HOTAIR在ALL增殖與凋亡中的作用，有利于為ALL的治療提供更有力的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在人ALL細(xì)胞系MOLT-4、CCRF-CEM和CEM-C1與人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞系HS-5的表達(dá)有顯著差異，分別是HS-5細(xì)胞中的4.43倍、3.50倍和4.89倍。因此，我們構(gòu)建si-HOTAIR，并選擇與HS-5表達(dá)差異倍數(shù)最高的CEM-C1細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究，在CEM-C1細(xì)胞證實(shí)構(gòu)建的si-HOTAIR能有效干擾HOTAIR的表達(dá)，沉默效率為(72.27±4.89)%，與此同時(shí)，對(duì)照空白序列si-NC的干擾效率與不加處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在此前提下，我們將si-HOTAIR轉(zhuǎn)染到CEM-C1細(xì)胞從而下調(diào)其HOTAIR的水平，發(fā)現(xiàn)HOTAIR的下調(diào)能抑制CEM-C1細(xì)胞的活力，抑制CEM-C1細(xì)胞的增殖，并能促進(jìn)CEM-C1細(xì)胞的凋亡，具體表現(xiàn)為促進(jìn)其形成凋亡小體，呈現(xiàn)體積明顯縮小的深染核形態(tài)；且凋亡的最后執(zhí)行分子caspase-3/7顯著上調(diào)。因此，HOTAIR能起到促進(jìn)ALL細(xì)胞增殖、抑制ALL細(xì)胞凋亡的作用。為了進(jìn)一步解釋“HOTAIR高表達(dá)的ALL患者預(yù)后不良”的問題，我們結(jié)合當(dāng)前ALL的主要治療藥物及其作用靶點(diǎn)進(jìn)一步研究上述現(xiàn)象的機(jī)制。

當(dāng)前對(duì)ALL的治療手段以減少ALL細(xì)胞數(shù)量的化學(xué)治療方法為主[14]。糖皮質(zhì)激素作為ALL化學(xué)治療方案的主要藥物，與ALL細(xì)胞的GR結(jié)合并激活GR，繼而啟動(dòng)下游一系列誘導(dǎo)ALL凋亡的信號(hào)通路，是發(fā)揮ALL治療作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此GR是糖皮質(zhì)激素治療ALL的重要分子，GR的激活是抑制ALL細(xì)胞增殖、促進(jìn)ALL細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮糖皮質(zhì)激素治療作用的主要機(jī)制之一[15]。然而長期大劑量應(yīng)用作為GR激動(dòng)劑的糖皮質(zhì)激素，會(huì)引起GR的向下調(diào)節(jié)，繼而產(chǎn)生耐藥性，表現(xiàn)為ALL對(duì)藥物的敏感性降低，預(yù)后變差[6, 16]。鑒于GR在ALL化學(xué)治療中的上述重要地位，我們研究HOTAIR是否通過對(duì)GR的調(diào)控來影響ALL的增殖和凋亡，以期為ALL提供靶點(diǎn)明確的治療方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用si-HOTAIR敲減糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞株CEM-C1的HOTAIR表達(dá)后，再應(yīng)用50 μmol/L糖皮質(zhì)激素Dex，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)顯著強(qiáng)于轉(zhuǎn)染si-NC后應(yīng)用等劑量Dex的處理。si-HOTAIR在mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著提高CEM-C1細(xì)胞GR的表達(dá)。說明HOTAIR的抑制能有效上調(diào)ALL主要化療藥物的作用靶點(diǎn)GR，且能提高其對(duì)化療藥物Dex的敏感性。

綜上所述，我們認(rèn)為，HOTAIR發(fā)揮調(diào)控ALL增殖與凋亡的作用，這種作用可能是通過調(diào)控GR來實(shí)現(xiàn)的。盡管對(duì)于HOTAIR對(duì)GR的調(diào)節(jié)機(jī)制，即“HOTAIR為何會(huì)誘導(dǎo)GR下調(diào)”的問題仍需進(jìn)一步深入探討，然而本研究為預(yù)測哪些患者適用“HOTAIR抑制劑+糖皮質(zhì)激素”的方案，提供了初步的理論依據(jù)以及新靶點(diǎn)、新策略。