miR-29b介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號通路對大鼠肝纖維化進(jìn)程的影響*

譚 潔， 田 霞， 韓 崢， 朱慶曦， 劉 蒙

(武漢大學(xué)同仁醫(yī)院， 武漢市第三醫(yī)院， 湖北 武漢 430060)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是存在于肝臟竇周狄氏間隙中的維生素A存儲細(xì)胞。HSC和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在肝纖維化發(fā)病過程中扮演重要的角色[1]。多種因素引起的肝損傷都可能激活HSC，而活化的HSC可釋放多種促進(jìn)纖維化進(jìn)程的細(xì)胞因子，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)[2-5]。研究表明， TGF-β對肝纖維化的調(diào)控主要是通過TGF-β/Smad信號通路實現(xiàn)，活化的TGF-β可激活TGF-β/Smad信號通路，進(jìn)而促進(jìn)HSC合成膠原和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，從而加速肝纖維化的發(fā)生。

微小RNA-29(microRNA-29,miR-29)是新近發(fā)現(xiàn)的一個與纖維化疾病密切相關(guān)的小分子RNA[6]。研究表明 miR-29b在肝纖維化小鼠和進(jìn)展性肝纖維化患者肝臟組織中的表達(dá)明顯下降[7-10]，且可抑制多種膠原蛋白的表達(dá)[11]，這提示miR-29b在肝纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，且很可能具有強大的抗纖維化潛能。此外miR-29還可通過抑制TGF-β/smad信號通路介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和致纖維化過程，在多種器官纖維化中起著重要的作用。

本研究通過檢測活化的HSC及肝纖維化動物模型獲取的HSC中miR-29b、TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白和肝纖維化標(biāo)志蛋白的水平變化，研究它們與HSC活化程度和肝纖維化的關(guān)聯(lián)性，后通過進(jìn)一步鑒定miR-29b對TGF-β1的直接靶向結(jié)合，探討肝纖維化過程中miR-29b對TGF-β/Smad信號通路的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究抗肝纖維化提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和主要試劑

14～16月齡雄性Wistar 大鼠12只，體重400～600 g，購自湖北省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，合格證編號為No.42000600016665。TRIzol RT RNA(MRC)；Eastep RT Master Mix Kit(Promega)；SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)，引物由TaKaRa公司設(shè)計；天狼星紅試劑盒(Bioswamp)；抗I型膠原(collagen type I，Col I)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(CST)；羊抗兔 II 抗(Genetex)。

2 實驗儀器

電泳儀及顯影儀(Bio-Rad)；酶標(biāo)儀(Thermo)；脫水機、包埋機、切片機和攤片烤片機(Leica)；正置顯微鏡(Nikon)；熒光定量PCR儀(ABI 7500)；全自動生化分析儀(PUZS-300X)。

3 方法

3.1豬血清誘導(dǎo)免疫性大鼠肝纖維化模型的制備及鑒定 無菌條件下制備豬血清，連續(xù)8周腹腔注射(每次0.5 mL，每周2次)免疫雄性Wistar大鼠以制備大鼠免疫性肝纖維化模型[12]。8周后處死大鼠，分離大鼠肝臟HSC,進(jìn)行體外培養(yǎng),并使用全自動生化分析儀將獲取的大鼠血清進(jìn)行肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測。

3.2HE染色及天狼星紅染色觀察膠原纖維 取肝纖維化模型大鼠肝臟用4%甲醛固定，按照組織制片的常規(guī)程序進(jìn)行脫水和包埋，以4 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，將切片用二甲苯脫蠟，以不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度脫水，然后伊紅染色(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，蘇木素(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)復(fù)染，梯度脫水，二甲苯通透，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察。同時取脫蠟后的組織切片用天狼星紅飽和苦味酸液染色15～30 min，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，二甲苯通透，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察。

3.3HSC的分離培養(yǎng)及實驗分組 取雄性Wistar 大鼠，分離門靜脈并插管，采用酶消化-密度梯度離心法分離HSC(依次灌注鏈酶蛋白酶-膠原酶，37 ℃原位消化，12% Nycodenz密度梯度離心獲得HSC)，并命名為初始HSC。所得HSC在含10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液[13]，體外培養(yǎng)2 d的作為靜息狀態(tài)HSC。取靜息狀態(tài)HSC與初始HSC進(jìn)行鑒定，鑒定成功的繼續(xù)培養(yǎng)7 d作為半活化狀態(tài)HSC，培養(yǎng)14 d作為完全活化狀態(tài)HSC，并取構(gòu)建成功的纖維化大鼠模型體外培養(yǎng)的HSC作為纖維化模型細(xì)胞，將細(xì)胞分為初始HSC(HSC-1)、靜息狀態(tài)HSC(HSC-2)、半活化狀態(tài)HSC(HSC-3)、完全活化狀態(tài)HSC(HSC-4)和纖維化模型HSC(HSC-5)，共5組。

3.4RT-qPCR檢測miR-29b及mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA(TRIzol法)，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書使用一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后按照RT-qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行PCR操作。檢測mRNA的反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex Taq II(2×) 10 μL；cDNA template 2 μL；引物10 μmol/L (F/R) 0.3 μL；RNase-free water 7.4 μL。檢測miRNA的反應(yīng)體系為： 5×MMLV RT buffer 4 μL； dNTP (10 mmol/L) 0.75 μL；miRNA/U6 snRNA RT Primer Mix(1 μmol/L)1.2 μL；RNasin (40 U/μL)0.5 μL；MMLV reverse transcriptase (200 U/μL) 0.2 μL；miRNA template 3 μg；RNase-free water 加至20 μL。按照2步法PCR標(biāo)準(zhǔn)程序擴增，擴增后RNA相對表達(dá)量計算公式為2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的相關(guān)引物序列

F: forward; R: reverse.

3.5Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(康為世紀(jì)公司)測定樣品蛋白含量并稀釋定量樣品，加上樣緩沖液煮沸變性后，配制10% Bio-Rad蛋白膠，以20 μg總蛋白量上樣，電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜，分別加 I 抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加 II 抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，并使用Bio-Rad公司的ChemiDoc Touch系統(tǒng)采集圖像及數(shù)據(jù)分析。

3.6雙螢光素酶報告基因檢測 依據(jù)GenBank中TGF-β1基因的序列，選取包含與miR-29b匹配的一段序列設(shè)計引物，然后進(jìn)行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物和載體pmirGLO進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆進(jìn)行驗證。轉(zhuǎn)染前 1 d將293T細(xì)胞接種于24孔板，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h后，PBS洗滌細(xì)胞，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System說明書向每個孔中加入100 μL PLB，室溫?fù)u動20 min后加入20 μL LAR-II試劑，放入GloMax@96 Microplate Luminomter(Promega)分別讀取螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶催化底物后的發(fā)光強度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用多因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 纖維化HSC的鑒定

對獲取的HSC進(jìn)行RT-qPCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)HSC(HSC組)中肝纖維化標(biāo)志蛋白Col I和α-SMA的mRNA表達(dá)水平是初始HSC(control 組)的4倍(P<0.01)，同時蛋白表達(dá)水平在HSC組是control組的2倍(P<0.01)，見圖1。肝纖維化標(biāo)志物Col I和α-SMA在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均增加，初步判斷纖維化HSC獲取成功。

2 肝纖維化模型大鼠的鑒定

肝纖維化模型大鼠血清肝纖維化指標(biāo) III型前膠原(procollagen type III，PC Ⅲ)、 IV型膠原(collagen type IV，Col IV)、層粘連蛋白(laminin，LN)及透明質(zhì)酸酶(hyaluromic acid，HA)均高于正常大鼠 (P<0.01)，見表2。對2組大鼠肝臟石蠟切片進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則，肝竇與匯管區(qū)成纖維細(xì)胞少；而纖維化模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積增大，有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞壞死，纖維組織增生明顯，見圖2。病理及血清肝纖維化指標(biāo)表明，肝纖維化模型大鼠病情發(fā)展較為嚴(yán)重，大鼠纖維化模型構(gòu)建成功。

3 不同活化狀態(tài)的HSC及肝纖維化HSC中相關(guān)蛋白及miR-29b表達(dá)的檢測

對不同活化狀態(tài)下的HSC及肝纖維化HSC進(jìn)行RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，隨著HSC活化程度的增加，直至轉(zhuǎn)化為肝纖維化HSC的過程中，miR-29b的表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05);同時與肝纖維化過程密切相關(guān)的TGF-β1、Col I、Smad2、Smad3、Smad4和α-SMA的mRNA水平隨著纖維化程度的加深逐漸增加，而對纖維化有抑制作用的Smad7的mRNA含量明顯減少(P<0.05),見圖3。進(jìn)一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、Col I、Smad2、Smad3、Smad4和α-SMA的蛋白表達(dá)量同樣隨著HSC細(xì)胞的活化程度逐漸增加，而Smad7蛋白的含量逐漸減少(P<0.05),見圖4。

Figure 1. The mRNA and protein expression of fibrosis-related genes in hepatic fibrosis rat HSC culturedinvitro. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1體外獲取的纖維化HSC相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化

表2 大鼠血清纖維化指標(biāo)的比較

**P<0.01vsnormal group.

Figure 2. The pathological observation of the rat liver with HE and Sirius red staining (×200).

圖2HE及天狼星紅染色大鼠肝臟病理切片的觀察

Figure 3.The expression of miR-296 and the mRNA expression of fibrosis-related genes in liver fibrosis process. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsHSC-1 group.

圖3纖維化過程中miR-296及與纖維化密切相關(guān)的mRNA表達(dá)水平的變化

Figure 4.The protein expression of fibrosis-related genes in liver fibrosis process. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsHSC-1 group.

圖4纖維化過程中與纖維化密切相關(guān)的蛋白表達(dá)水平的變化

4 雙熒光素酶靶點預(yù)測

運用TaragetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)TGF-β1為miR-29b的下游靶基因之一，miR-29b與TGF-β1 mRNA的3’-UTR互補序列見圖5A。雙螢光素酶報告系統(tǒng)驗證結(jié)果顯示，在野生型(WT)組中miR-29b mimic與TGF-β1結(jié)合后的熒光強度明顯低于對照(NC)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而在Mut組中miR-29b組與NC組間的差異并沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖 5B。以上結(jié)果證實miR-29b可直接靶向于TGF-β1的3’-UTR。

討 論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[14]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)HSC持續(xù)活化所導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積是肝纖維發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。正常狀況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到外界刺激時HSC會被激活并持續(xù)增殖，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，最終形成肝纖維化[15]。

TGF-β在肝纖維化的發(fā)生過程中具有重要的作用，其作為一種關(guān)鍵的促纖維化因子，可增強ECM的表達(dá)，而I型膠原蛋白和α-平滑肌動蛋白等是構(gòu)成ECM的重要組成部分，通常作為肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)記物[16-17]。Smad4作為TGF-β/Smad信號通路的重要的下游分子，TGF-β受體二聚化后會激活Smad2/Smad3，進(jìn)而使其形成復(fù)合物，隨后Smad2/Smad3復(fù)合物與Smad4結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核，最后與特異的DNA連接蛋白結(jié)合，從而促進(jìn)TGF-β的表達(dá)[18-19]形成穩(wěn)定的異源多聚體，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與各種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，進(jìn)而啟動纖維化相關(guān)基因的表達(dá)[20]；而Smad7能通過與活化的TGF-β1結(jié)合從而抑制該信號通路的激活[21]，進(jìn)而抑制纖維化的進(jìn)程。

Figure 5. Direct targeted binding of miR-29b to TGF-β1. A: prediction of the binding sites; B: relative luciferase activity. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖5miR-29b與TGF-β1的直接靶向結(jié)合

本研究通過體外獲取HSC及肝纖維化HSC，檢測不同活化程度的HSC及肝纖維化HSC的miR-29b及相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著HSC活化程度的加深，miR-29b的表達(dá)量逐漸減少。且在HSC活化直至纖維化進(jìn)程中，TGF-β/Smad信號通路中Smad2/3/4的表達(dá)逐漸增加，而Smad7的表達(dá)則隨之下降。后通過雙螢光素酶系統(tǒng)對miR-29b的靶位點進(jìn)行初步驗證，可發(fā)現(xiàn)TGF-β1為miR-29b的直接下游靶點。由此可判斷miR-29b可能通過抑制TGF-β1進(jìn)而調(diào)控TGF-β/Smad信號通路，最終抑制HSC的增殖和活化引起的肝纖維化。

綜上所述，本研究證實在肝纖維化發(fā)展過程中，miR-29b隨著HSC的活化逐漸降低，且其可能是通過調(diào)控TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮其作用的。這初步揭示了miR-29b及TGF-β/Smad信號通路在肝纖維化發(fā)展中的作用，并為肝硬化的治療提供了新的治療靶點。