輻射誘導(dǎo)大鼠腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及其自噬的變化*

馮會(huì)超， 陳乃耀， 崔亞歡, 周 葳， 劉湄漪， 劉 競

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 河北 唐山 063000)

放療是治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤的有效方案，但可不同程度地?fù)p傷神經(jīng)系統(tǒng)。放射性腦損傷(radiation-induced brain injury，RBI)可損傷神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)和血管。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes)廣泛存在于腦組織各個(gè)部位，并可通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子及抗氧化因子保護(hù)神經(jīng)元，而過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種炎癥因子，包括白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和CCL2[1-3]，可見星形膠質(zhì)細(xì)胞密切參與腦組織的損傷及修復(fù)。自噬是真核細(xì)胞特有的降解細(xì)胞內(nèi)代謝物的過程[4]，可通過溶酶體途徑清除細(xì)胞內(nèi)的代謝廢物，從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，但過度的自噬激活會(huì)加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]。因此在某些疾病變化中，適當(dāng)抑制自噬可能會(huì)延緩疾病的進(jìn)展。目前，研究多集中于神經(jīng)元自噬水平在急性腦損傷中的作用，而對星形膠質(zhì)細(xì)胞研究較少，其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)研究放療后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及自噬的變化情況，以探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在放射性腦損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠36只，體重180～200 g，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司。大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫控制在(22±2) ℃，每天保持12 h自然光照，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)處理前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、模型(model)組和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)組，每組12只。

1.2主要試劑 抗LC3蛋白抗體購于MBL；抗神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen, NeuN)抗體、抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體和抗β-actin抗體購于Abcam;抗cleaved caspase-3抗體購于北京博奧森公司；自噬抑制劑3-MA購于Cayman；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購于中國武漢基因美公司。

2 方法

2.1RBI大鼠模型的制作 采用單次全腦照射20 Gy X射線制作RBI模型。大鼠均于照射前12 h禁食，5%水合氯醛按 6 mL/kg進(jìn)行腹腔麻醉，置于放療臺上進(jìn)行照射，照射過程均于5 min以內(nèi)完成;其中sham組同樣給予禁食、麻醉，但不予照射。照射完成后立即固定于大鼠立體定位儀上，剪開頭皮，露出顱骨，用H2O2消化表面組織，借助于立體定位儀定位大鼠側(cè)腦室坐標(biāo)，model組用微量進(jìn)樣器注射0.9% NaCl 5 μL，3-MA組注射3-MA 600 nmol (用0.9% NaCl稀釋至終體積5 μL)，sham組切開頭皮，不予注射藥物。繼續(xù)如前飼養(yǎng)8周。

2.2學(xué)習(xí)和記憶能力的測試 采用Morris 水迷宮測試[6]。實(shí)驗(yàn)室室溫(22±2) ℃， 水溫22 ℃，屋頂和四壁表面光滑整潔，用黑色遮光布避光， 照明設(shè)備位于水迷宮正上方，燈光柔和。各組大鼠均于照射前4 d進(jìn)行訓(xùn)練：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：操作者將大鼠面向池壁置于平臺之外3個(gè)象限中間位置，記錄大鼠行動(dòng)軌跡以及120 s內(nèi)爬上平臺所需時(shí)間(逃避潛伏期)。大鼠爬上平臺后站立30s，放回鼠籠休息60 s。若大鼠于120 s內(nèi)未找到平臺，則將其牽引至平臺，站立30 s，逃避潛伏期記為120 s，放回鼠籠休息60 s。每天上、下午各訓(xùn)練4次，共4 d；(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，撤除平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)。所有大鼠均于8周處理前再次進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，條件及操作同上，記錄大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。

2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色 用5%水合氯醛對大鼠進(jìn)行深度麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽出血液，4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，進(jìn)一步在4 ℃固定過夜。石蠟包埋，在低溫恒溫器中獲得連續(xù)切片。依HE染色步驟細(xì)心操作。觀察同側(cè)海馬組織病理變化，每組3只。

2.4Western blot檢測相關(guān)蛋白水平 將冰凍腦組織取出，分離海馬,移至EP管中，用小剪刀盡量剪碎，按照50 mg腦組織加入300 μL RIPA裂解液混勻，用超聲勻漿機(jī)輔助裂解30 min(各步驟均于冰上操作)。高速離心，取上清為待測蛋白樣品。用12%的SDS-PAGE分離樣品(每孔50 μg)。按照NeuN、GFAP和cleaved caspase-3抗體說明書提示分子量，對比Marker切下目的蛋白。依次轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育抗體。用AB發(fā)光液(北京普利萊公司)進(jìn)行顯影，結(jié)果用ImageJ進(jìn)行條帶灰度分析，以目的蛋白與β-actin的比值作為蛋白相對表達(dá)量。每組各3只。

2.5免疫組織化學(xué)染色 切片充分脫蠟；依次浸二甲苯、梯度濃度乙醇和蒸餾水。高壓修復(fù)4 min(枸櫞酸鹽倒入修復(fù)盒，蓋上蓋子，放入高壓蒸汽鍋，待蒸汽噴出后開始計(jì)時(shí)4 min)，流水冷卻15 min；3% H2O2覆蓋、5% BSA封閉；滴加Ⅰ抗，4 ℃過夜。37 ℃ 1 h復(fù)溫；加增強(qiáng)劑；孵育Ⅱ抗(羊抗兔)DAB(北京中杉金橋公司)顯色；PBS洗凈；復(fù)染、封片。

2.6免疫熒光染色 免疫熒光的主要抗體是小鼠抗體GFAP(1∶200)，兔抗大鼠LC3(1∶200)。用5% BSA封閉后，加 I 抗共孵，4 ℃過夜。復(fù)溫后滴加熒光II 抗;II 抗是用于GFAP的Alexa Fluor 568山羊抗小鼠和用于LC3的Alexa Fluor 488山羊抗兔抗體。我們對GFAP和LC-3進(jìn)行雙重標(biāo)記，以檢測自噬蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。

2.7TUNEL染色法檢測海馬區(qū)細(xì)胞凋亡 遵循TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。二甲苯中脫蠟，然后先后于正丁醇及各濃度乙醇洗滌，PBS洗凈后，滴加3%H2O2，依次滴加Equilibration Buffer、工作濃度的TdT酶和anti-digoxignenin conjugate，DAB顯色，0.5%甲基綠室溫孵育，最后二甲苯脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.8ELISA法檢測海馬TNF-α和IL-6的含量 各組大鼠飼養(yǎng)8周后，用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行深度麻醉。大腦快速解剖。分離海馬標(biāo)本，切成小塊，抽吸至移液管中，用超聲勻漿機(jī)勻漿8 s(各步驟均于冰上操作)。將勻漿在7 500 r/min離心20 min。 上清液用于測量TNF-α和IL-6。使用商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(中國武漢基因美公司)測量TNF-α和IL-6濃度，并遵循制造商的說明書。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RBI后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析各組定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可見，第1、2天，各組數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；從第3天開始model組大鼠的逃避潛伏期較sham組明顯延長(P<0.05)，3-MA組較model組有所縮短(P<0.01),結(jié)果提示RBI后，大鼠尋找水下平臺潛伏期明顯延長，出現(xiàn)一定的學(xué)習(xí)功能障礙，給予3-MA后，其學(xué)習(xí)能力有一定程度的恢復(fù)，見表1。

表1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的比較

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

1.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析各組空間探索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可見，與sham組相比，model組的穿越平臺數(shù)明顯減少，3-MA組次數(shù)有所增加(P<0.05)。結(jié)果提示RBI后，大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少，表現(xiàn)出記憶功能障礙,自噬抑制劑組大鼠情況有所好轉(zhuǎn)，空間記憶能力有一定程度的恢復(fù)，見圖1。

Figure 1.The times of crossing platform in space exploration experiments of the rats in each group. Mean±SD.n=12.△△P<0.01vssham group;*P<0.05vsmodel group.

圖1各組大鼠空間探索試驗(yàn)穿越平臺次數(shù)的比較

2 RBI后大鼠海馬區(qū)組織HE染色觀察結(jié)果

RBI后對大鼠腦組織HE染色，觀察海馬區(qū)病理變化。HE染色結(jié)果顯示model可見明顯細(xì)胞核固縮，錐體束結(jié)構(gòu)紊亂；3-MA組變化較輕，見圖2。結(jié)果表明RBI后8周，海馬區(qū)結(jié)構(gòu)明顯受損，自噬抑制劑可減少組織損傷，促進(jìn)組織修復(fù)。

Figure 2.HE staining for observing the pathological changes of ipsilateral hippocampus (×200).

圖2同側(cè)海馬組織HE染色結(jié)果

3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白， RBI后用GFAP的免疫組織化學(xué)染色評估星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的變化，結(jié)果顯示RBI后8周，model組活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少；3-MA組活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞較model組增多(P<0.01)。RBI后8周星形膠質(zhì)細(xì)胞較對照組活化降低，而3-MA組活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，表明自噬抑制劑可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，見圖3。

Figure 3.Immunohistochemical staining of GFAP in the ipsilateral hippocampus (×400). The arrows indicated positive cells. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

圖3同側(cè)海馬區(qū)GFAP免疫組織化學(xué)染色

4 雙重?zé)晒馊旧^察自噬蛋白的表達(dá)情況

LC3是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白，用雙重?zé)晒馊旧椒▽FAP和LC3進(jìn)行染色，觀察RBI后星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，sham組有一些LC3陽性細(xì)胞，表明正常腦組織有星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬活性;RBI后8周，model組的LC3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);3-MA組 的LC3表達(dá)較model組明顯下調(diào)(P<0.01),結(jié)果表明RBI可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，3-MA可明顯降低自噬表達(dá)量，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，見圖4。

Figure 4.Immunofluorescence staining was used to determine GFAP-positive (red) and LC-3 positive (green) cells in the ipsilateral hippocampus (×400). The arrow indicated positive cells. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

圖4免疫熒光染色確定同側(cè)海馬GFAP陽性(紅色)和LC-3陽性(綠色)細(xì)胞

5 Western blot分析蛋白表達(dá)

NeuN是神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白，分子量50 kD 左右，Western blot顯示雙條帶，用NeuN的蛋白表達(dá)量來表示各組神經(jīng)元的數(shù)量,結(jié)果顯示 RBI 8周后，sham組NeuN有一定的表達(dá)量，model組表達(dá)量較sham組明顯減少(P<0.01)，3-MA組較model組增多(P<0.05)。結(jié)果表明RBI造成大鼠海馬區(qū)受損，海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，自噬抑制劑可能通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性增加神經(jīng)元數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，見圖5。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，分子量為55 kD 左右，用GFAP的表達(dá)量來表示其活化程度,結(jié)果可見RBI 8周后，model組GFAP表達(dá)相較于sham組明顯減少(P<0.01)，3-MA組較model組明顯增多(P<0.05)。RBI后GFAP表達(dá)量明顯下調(diào)，表明輻射損傷后可大量抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，從而加重海馬區(qū)損傷;3-MA可通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減輕海馬區(qū)損傷情況,見圖6。

檢測cleaved caspase-3的表達(dá)量來表示海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，RBI后model組的cleaved caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，3-MA組其表達(dá)量較model組下調(diào)(P<0.05)。這表明RBI后，海馬區(qū)凋亡蛋白明顯上調(diào)，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡；而3-MA可降低caspase-3的表達(dá)，從而達(dá)到緩解效果，見圖7。

Figure 5.The protein expression of NeuN in the same side of hippocampal tissues determined by Western blot ana-lysis. Mean±SD.n=3.△△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group.

圖5同側(cè)海馬組織NeuN的Wersternblot分析

6 TUNEL染色法檢測海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況

TUNEL檢測海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況，甲基綠染色后可見中空的凋亡小體。

Figure 6.The protein expression of GFAP in the same side of hippocampal tissues determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.△△P<0.01vssham group;*P<0.05vsmodel group.

圖6同側(cè)海馬組織GFAP的Westernblot分析

Figure 7.The protein expression of cleaved caspase-3 in the same side of hippocampal tissues determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group.

圖7同側(cè)海馬組織caspase-3的Westernblot分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,sham組僅有極少數(shù)凋亡陽性細(xì)胞；相較于sham組，model組可見大量TUNEL陽性細(xì)胞；相較于model組，3-MA組TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，見圖8。

7 ELISA法檢測炎癥因子IL-6和TNF-α含量

通過ELISA法檢測IL-6和TNF-α在RBI后8周的表達(dá)，評估炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示，RBI后8周，各組大鼠炎癥變化雖有趨勢，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明雖然RBI急性期炎癥反應(yīng)明顯，但8周后炎癥反應(yīng)已恢復(fù)正常，見圖9。

討 論

本研究中，中等劑量輻射后大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞受到抑制，而3-MA可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，同時(shí)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦組織恢復(fù)。以上結(jié)果表明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬可能是放射性腦損傷新的治療方向。

自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種代謝途徑，主要通過溶酶體途徑對胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解。LC3是檢測自噬表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)。正常情況下，自噬在調(diào)控通路參與下保持穩(wěn)定狀態(tài)；但在一些病理狀態(tài)下，自噬發(fā)生過度活化或受到抑制從而加重原有的損傷。自噬可以由不同的條件高度誘導(dǎo)，如營養(yǎng)剝奪、氧化應(yīng)激、缺氧和化療藥物[7-10]。有學(xué)者研究自噬的表達(dá)發(fā)現(xiàn)[11-13]，線粒體自噬的不足和過度都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的損傷和死亡；Jin等[14]通過對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后自噬變化的研究，檢測到受損后的大鼠腦組織自噬明顯上調(diào)，使用自噬抑制劑以后進(jìn)一步加重原有損傷；而在帕金森病相關(guān)研究中，Redmann等[15]發(fā)現(xiàn)，用自噬激活劑海藻糖作用于PD模型后發(fā)現(xiàn)海藻糖通過增加LC3-II水平而上調(diào)自噬，使PD的小鼠模型癥狀有所緩解，說明PD的癥狀可能與自噬下調(diào)，異常蛋白蓄積有關(guān)；類似的，陶紅苗等[16]學(xué)者通過對缺血后大鼠模型進(jìn)行自噬抑制劑干預(yù)，發(fā)現(xiàn)通過減少細(xì)胞內(nèi)自噬而減輕腦缺血再灌注損傷，可能與增強(qiáng) mTOR 作用有關(guān)；而Zhang等[17]利用經(jīng)典的自噬激活劑雷帕霉素作用于肌萎縮側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因小鼠后發(fā)現(xiàn)其能夠加速疾病進(jìn)程，促進(jìn)小鼠的死亡?？梢娮允煞€(wěn)定是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生理過程，過度激活會(huì)加重原有組織和細(xì)胞的損傷，而受到抑制會(huì)使受損細(xì)胞器及代謝產(chǎn)物不能及時(shí)排出，從而對組織和細(xì)胞造成慢性持續(xù)性損傷。

Figure 8.TUNEL staining of the ipsilateral hippocampus region. Arrows indicated TUNEL-positive cells (×400). Mean±SD.n=3.△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

圖8同側(cè)海馬區(qū)TUNEL檢測

Figure 9.The expression of inflammatory factors in the ipsilateral hippocampus detected by ELISA. Mean±SD.n=3.

圖9ELISA檢測同側(cè)海馬炎癥因子的表達(dá)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中主要的膠質(zhì)細(xì)胞，具有穩(wěn)固神經(jīng)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)代謝功能。 此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞面對各種病理性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，如創(chuàng)傷性損傷、缺血、神經(jīng)毒性化學(xué)物質(zhì)、腫瘤、感染和神經(jīng)退行性疾病等，可發(fā)生形態(tài)學(xué)和某些分子表達(dá)的變化[18]。據(jù)報(bào)道，射頻照射引起神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡[19-20]，神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂[21]和認(rèn)知障礙[22]，并增加血腦屏障的通透性[23]。在輻射早期，Astroglia GFAP表達(dá)量明顯增加可促進(jìn)炎癥因子的釋放[24]，并且是通過NF-κB、AP-1和CREB等通路來介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[25]。在AD患者中，星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過內(nèi)化和降解β-淀粉樣蛋白，從而緩解AD患者的病變，因而星形膠質(zhì)細(xì)胞活性下降可通過減少毒性物質(zhì)的降解和排出，從而加重原有病情[26]，本實(shí)驗(yàn)中，通過射線對大鼠造成腦損傷，Western blot法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP，發(fā)現(xiàn)GFAP表達(dá)明顯減少，雙熒光染色發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，這意味著放射損傷8周后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活性明顯下調(diào)，神經(jīng)營養(yǎng)因子及其它保護(hù)因子釋放減少，腦損傷不能得到修復(fù)，而給予自噬抑制劑后GFAP表達(dá)明顯上調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平下降，通過凋亡相關(guān)指標(biāo)及NeuN等指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑組壞死神經(jīng)元減少，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)好轉(zhuǎn)，使腦損傷有一定程度的恢復(fù)。

總之,大鼠輻射損傷后海馬區(qū)損傷明顯，神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，3-MA可顯著緩解受損程度，阻止神經(jīng)元的過度凋亡，其機(jī)制可能是射線對PI3K/Akt/mTOR通路的激活[26]，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)可能會(huì)為放射性腦損傷的治療提供新途徑，但仍需廣大學(xué)者進(jìn)一步研究。