苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病病原真菌細(xì)胞壁膜的作用

劉雪 關(guān)麗杰

摘要：初步探究苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病病菌的抑菌機(jī)制。采用紫外分光光度法測(cè)定參與水稻稻瘟病病菌細(xì)胞壁降解的2個(gè)關(guān)鍵酶（幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶）活性以及菌體細(xì)胞外的磷濃度;采用熒光分光光度法測(cè)定PI-DNA復(fù)合物（碘化吡啶）熒光強(qiáng)度;采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）測(cè)定甾醇類(lèi)物質(zhì)含量變化。結(jié)果表明，用10 mg/L苯丙烯菌酮處理水稻稻瘟病病菌后，菌體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性均升高，藥劑處理1 h后酶活性明顯升高，分別是對(duì)照組的1.69倍和3.76倍，細(xì)胞外的磷濃度在1 h后明顯升高，3 h時(shí)是對(duì)照組的1.29倍，24 h時(shí)PI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度急劇升高，為對(duì)照組的19.71倍，然后用10 mg/L苯丙烯菌酮處理6 h后6-乙酰氨基麥角甾醇含量與對(duì)照組相比減少了96.83%，酵母甾醇則消失。結(jié)果表明，苯丙烯菌酮可以破壞水稻稻瘟病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜功能結(jié)構(gòu)，起到抑菌作用。

關(guān)鍵詞：水稻稻瘟病菌;殺真菌劑;苯丙烯菌酮;作用機(jī)制;植物病原真菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.111.4+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0117-04

水稻稻瘟病是一類(lèi)重要的水稻病害，并且水稻稻瘟病病菌侵染能力強(qiáng)，能在短時(shí)間內(nèi)快速傳播[1-2]，同時(shí)易發(fā)生菌絲融合現(xiàn)象，形成多核體，這種變異增加了水稻病害防治工作的難度[3]。全球每年因?yàn)樗緶p產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，迫切需要一種新型環(huán)境友好的殺菌劑來(lái)解決水稻病害[4]。苯丙烯菌酮?jiǎng)e稱(chēng)異補(bǔ)骨脂查爾酮，是天然植物補(bǔ)骨脂提取物中的一個(gè)重要活性成分。有研究表明，二聚黃酮類(lèi)化合物對(duì)人類(lèi)致病酵母菌和絲狀真菌均有較好的抑菌效果[5]，查爾酮類(lèi)化合物也具有優(yōu)良的抗細(xì)菌真菌活性[6]。據(jù)報(bào)道，異補(bǔ)骨脂查爾酮具有多種藥理活性，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎和抗腫瘤作用[7]。Zhang等在抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 KB-1122對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，經(jīng)過(guò)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白組分析試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和絲氨酸蛋白激酶與枯草桿菌KB-1122的抑菌作用密切相關(guān)[8]。檸檬醛可以提高幾丁質(zhì)酶活性，從而破壞水稻稻瘟病菌細(xì)胞壁完整性，達(dá)到抑菌目的[9]。硝基苯乙烯類(lèi)化合物能明顯抑制稻瘟病菌的黑色素合成相關(guān)酶3HNR的活性，顯示出抑菌效果[10]。

盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了苯丙烯菌酮乳油劑對(duì)稻瘟病菌有較好的防治效果[11]。掃描電鏡結(jié)果顯示，經(jīng) 10 mg/L 苯丙烯菌酮處理后，水稻稻瘟病菌菌絲界限變得模糊，且相互交連發(fā)生融合，菌體形態(tài)發(fā)生了明顯變化。本試驗(yàn)為進(jìn)一步明確苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病菌的殺菌機(jī)制，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞壁水解酶（幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶）活性[12-13]、細(xì)胞膜通透性試驗(yàn)、PI熒光檢測(cè)和甾醇類(lèi)物質(zhì)成分分析試驗(yàn)，探究苯丙烯菌酮對(duì)稻瘟病菌菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的作用[14-15]，為苯丙烯菌酮?dú)⒕饔锰峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 苯丙烯菌酮（異補(bǔ)骨脂查爾酮），購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;丙酮，購(gòu)自福晨（天津）化學(xué)試劑廠;葡萄糖，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;酵母浸粉，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司;瓊脂，購(gòu)自福建省金燕海洋生物科技股份有限公司。

1.1.2 供試菌種 水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae Cav.），由沈陽(yáng)化工研究院生物測(cè)定中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)條件 稻殼培養(yǎng)基（1 000 mL）：稻殼30 g，葡萄糖5.0 g，酵母浸粉1.4 g，瓊脂20～25 g，MgSO4 0.25 g。

PDA液體培養(yǎng)基（1 000 mL）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g。

1.1.4 主要儀器 DHG-9149A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MPLR-702四孔恒溫水浴鍋，購(gòu)自金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;SHZ-DZⅢ循環(huán)水式真空泵，購(gòu)自河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠;SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎儀，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-IG單人凈化工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司;TBL-16G-A高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;TSQ-280振蕩培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯丙烯菌酮對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞壁的影響

1.2.1.1 菌絲的制備 取5 mL水稻稻瘟病菌孢子懸液接入PDA培養(yǎng)液中，置于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后進(jìn)行處理，苯丙烯菌酮處理濃度為10 mg/L，對(duì)照加等量丙酮，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。藥劑處理后，在時(shí)間為0、1、3、6、12、24 h收集菌絲，抽干水分后在-20 ℃下保存。

1.2.1.2 酶液的提取 稱(chēng)取1 g菌絲，加入5 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH值7.5）緩沖液，超聲破碎30 min（工作5 s間歇3 s）。然后將破碎的細(xì)胞勻漿轉(zhuǎn)移至EP管中，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 幾丁質(zhì)水解酶含量測(cè)定 向潔凈的試管中加入 0.2 mL 膠狀幾丁質(zhì)，用0.1 mL乙酸鈉緩沖液（濃度為 0.1 mol/L，pH值4.5）和不同時(shí)間處理酶液0.3 mL，于40 ℃下水浴1 h（空白用三蒸水代替酶液），流水冷卻至室溫。12 000 r/min 離心10 min，移取上清液0.25 mL，加40 μL 10%脫鹽蝸牛酶，37 ℃保溫存1 h，冷卻。然后加0.1 mL硼酸鉀溶液（0.8 mol/L），沸水浴3 min，冷卻至室溫，加2 mL 1%二甲基胺硼烷（DMAB）溶液于37 ℃水浴20 min，冷卻，于波長(zhǎng)585 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.059x-0.007（r2=0.997）進(jìn)行計(jì)算。以單位鮮質(zhì)量樣品在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的N-乙酰葡萄糖胺為1個(gè)酶活力單位。

U=（D-Do）×VtFW×Vs×t。

式中：D為樣品中幾丁質(zhì)酶水解生成的N-乙酰葡萄糖胺含量;Do為空白組N-乙酰葡萄糖胺含量;Vt為酶液總體積，mL;Vs為反應(yīng)酶液體積，mL;FW為樣品的鮮質(zhì)量，g;t為反應(yīng)時(shí)間，h。

1.2.1.4 β-1，3-葡聚糖水解酶含量測(cè)定 β-1，3-葡聚糖水解酶含量測(cè)定的反應(yīng)體系包括0.05 mol/L pH值5.0的乙酸鈉緩沖液（含1%昆布多糖）、0.16 mL 0.05 mol/L乙酸鈉（pH值5.0）緩沖液和300 μL各處理酶液（空白用三蒸水代替酶液），充分混勻，37 ℃保溫1 h，使其充分水解為葡萄糖，采用DNS法測(cè)定還原糖的量，向各反應(yīng)體系中加入 3，5-二硝基水楊酸試劑沸水浴5 min，流水立即冷卻，定容至 3 mL，于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)D值[16]。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性：y=0.173x-0.009，r2=0.998。以單位鮮質(zhì)量樣品在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的還原糖為1個(gè)酶活力單位。

U=（D-Do）×VtFW×Vs×t。

式中：D為樣品中β-1，3葡聚糖水解酶水解生成的還原糖含量;Do為空白組還原糖含量;Vt為酶液總體積，mL;Vs為反應(yīng)酶液體積，mL;FW為樣品的質(zhì)量，g;t為反應(yīng)時(shí)間，h。

1.2.2 苯丙烯菌酮對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜的影響

1.2.2.1 菌懸液的制備 取5 mL水稻稻瘟病菌孢子懸液接入PDA培養(yǎng)液中，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后進(jìn)行處理，苯丙烯菌酮處理濃度為10 mg/L，對(duì)照加等量丙酮，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。藥劑處理后0、1、3、6、12、24 h取樣。

1.2.2.2 磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)100 ℃干燥至恒質(zhì)量的磷酸二氫鉀43.9 g，加水溶解并定容至250 mL，精確量取10 mL于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得到0.004 mg/mL的參比溶液。分別取參比試劑0、1、3、5、7、9 mL于25 mL具塞試管中，加6 mL定磷試劑[水 ∶ 3 mol/L 硫酸 ∶ 2.5%鉬酸銨 ∶ 10%維生素C為 2 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1]，加水稀釋至25 mL，搖勻，45 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以磷濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.242 8x+0.009 6，r2=0.996。

1.2.2.3 胞外磷濃度含量測(cè)定 分別在藥劑處理后0、1、3、6、12、24 h取菌懸液8 mL，3 000 r/min離心10 min，精確量取上清液5 mL于平底燒瓶中，加9 mol/L硫酸溶液5 mL，直火緩慢加熱15 min，冷卻至室溫，滴加過(guò)氧化氫5 mL，繼續(xù)加熱15 min，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，精確量取5 mL，余下步驟同“1.2.2.2”節(jié)磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷濃度，磷濃度單位為μg/mL。

1.2.2.4 PI-DNA熒光檢測(cè) 用滅菌后的超純水配制 50 μg/mL 的PI溶液，置于棕色瓶?jī)?nèi)，4 ℃下避光保存。取 5 mL 菌懸液于離心管中，加入1 mL PI溶液和1 mL藥劑，充分混合，在37 ℃下進(jìn)行溫育反應(yīng)，分別在反應(yīng)0、1、3、6、12、24 h時(shí)測(cè)定其熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535、615 nm）。

1.2.2.5 甾醇成分分析 取菌絲0.5 g于50 mL具塞試管中，加2.5 mL PBS和6 mL新鮮配制的皂化劑，充分混勻，80 ℃ 水浴皂化1 h。加6 mL石油醚60 ℃提取3次，收集餾分，加水洗滌。醚層60 ℃水浴揮干石油醚，得到未皂化脂，加色譜純環(huán)己烷（1 mL/g濕菌）后于-20 ℃保存[17]。

色譜條件：5% HP-5MS（Phenyl Siloxane）30.0 m×0.250 mm×0.25 μm;柱溫：初溫度100 ℃，最終溫度300 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣：氦氣1.0 mL/min。質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)：NBS譜庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病菌細(xì)胞壁的影響

2.1.1 苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶活性的影響 由圖1可知，經(jīng)10 mg/L苯丙烯菌酮處理后，菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性明顯高于對(duì)照組。藥劑處理1 h，幾丁質(zhì)酶活性為對(duì)照組1.69倍，處理3、6、12、24 h后分別是對(duì)照組的1.41倍、1.54倍、1.33 倍、1.43倍。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，是由N-乙酰葡糖胺通過(guò)β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖。幾丁質(zhì)酶活性升高導(dǎo)致幾丁質(zhì)水解速度加快，細(xì)胞壁幾丁質(zhì)層受損，其功能受到影響，使菌體無(wú)法正常生長(zhǎng)。

2.1.2 苯丙烯菌酮對(duì)水稻稻瘟病菌β-1，3-葡聚糖酶活性的影響 由圖2可知，藥劑處理組菌體內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶活性明顯高于對(duì)照，在藥劑處理后1、3、6、12、24 h后分別是對(duì)照組的3.76倍、2.33倍、3.91倍、1.29倍、1.81倍。葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖，葡萄糖單元之間以糖苷鍵連接，是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分。經(jīng)苯丙烯菌酮處理后，菌體內(nèi)β-1，3葡聚糖酶活性升高，葡聚糖發(fā)生水解，引起稻瘟病菌細(xì)胞壁降解，所以藥劑通過(guò)破壞真菌細(xì)胞壁達(dá)到抑菌目的。

2.2 苯丙烯菌酮對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜的影響

2.2.1 苯丙烯菌酮對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜通透性的影響 磷是真菌細(xì)胞內(nèi)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要以多磷酸鹽形式存在，正常細(xì)胞胞外磷濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于胞內(nèi)磷濃度，但當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，胞液滲漏可使胞外磷濃度升高，分別在藥劑處理菌懸液0、1、3、6、12、24 h后取菌懸液測(cè)定胞外磷濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在藥劑處理1 h后胞外磷濃度明顯升高，藥劑處理1、3、6、12、24 h后胞外磷濃度分別是對(duì)照組的1.12倍、1.29倍、1.31倍、1.31倍、1.17倍。由此可知，殺菌劑苯丙烯菌酮處理菌體細(xì)胞后，真菌細(xì)胞膜發(fā)生一定程度的破損，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄露。

2.2.2 PI-DNA熒光檢測(cè)結(jié)果 PI是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色劑，它是一種溴化吡啶的類(lèi)似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞處于凋亡晚期或者死亡時(shí)，染色劑才可以進(jìn)入細(xì)胞并與核酸物質(zhì)結(jié)合形成PI-DNA復(fù)合物，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，在藥劑處理菌懸液1 h內(nèi)，復(fù)合物熒光值沒(méi)有明顯變化，處理1 h后熒光值緩慢上升，處理3、6、12 h時(shí)分別是對(duì)照組的6.35倍、3.24倍、8.30倍，24 h時(shí)復(fù)合物熒光值急劇升高為對(duì)照組的19.71倍。由此可以推測(cè)，苯丙烯菌酮處理稻瘟病菌后，菌體胞膜嚴(yán)重受損，染色劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)1 h后，菌體開(kāi)始慢慢凋亡，24 h時(shí)細(xì)胞達(dá)到凋亡晚期，細(xì)胞膜完全破裂，細(xì)胞最終死亡。

2.2.3 苯丙烯菌酮對(duì)甾醇類(lèi)物質(zhì)含量的影響 由圖5至圖7可知，10 mg/L苯丙烯菌酮處理后菌體酵母甾醇消失，6-乙酰氨基麥角甾醇成分減少。表1顯示，苯丙烯菌酮處理組與空白組、對(duì)照組相比分別減少了96.83%、97.07%。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要成分，與細(xì)胞膜流動(dòng)性和穩(wěn)定性密切相關(guān)。麥角甾醇含量降低，細(xì)胞膜會(huì)形成小孔，而酵母甾醇是麥角甾醇的前體物質(zhì)。由此可見(jiàn)，苯丙烯菌酮可能作用于麥角甾醇合成途徑，破壞稻瘟病菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，起到抑菌作用。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)真菌細(xì)胞壁水解相關(guān)酶活性的測(cè)定，結(jié)果表明，用10 mg/L苯丙烯菌酮處理稻瘟病菌后幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶，其活性均升高，藥劑處理1 h，幾丁質(zhì)酶活性為對(duì)照組1.69倍;β-1，3葡聚糖酶在藥劑處理1、3、6、12、 24 h后分別是對(duì)照組的3.76倍、2.33倍、3.91倍、1.29倍、1.81倍。幾丁質(zhì)和葡聚糖都是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，其水解酶活性升高會(huì)加快細(xì)胞壁降解，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而影響其功能。稻瘟病菌胞外磷濃度在藥劑處理1 h后含量增加，是對(duì)照組的1.12倍;PI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度在藥劑處理24 h時(shí)顯著升高為對(duì)照組的19.71倍;膜通透性試驗(yàn)和PI熒光檢測(cè)試驗(yàn)表明，苯丙烯菌酮可以破壞菌體細(xì)胞膜功能，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄露，并且細(xì)胞膜完整性遭到破壞，菌體最終死亡。甾醇成分分析結(jié)果顯示，細(xì)胞膜上麥角甾醇合成途徑受阻，細(xì)胞膜形成小洞，流動(dòng)性和穩(wěn)定性下降。綜上，苯丙烯菌酮可以破壞稻瘟病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能及其完整性，從而達(dá)到抑菌目的。

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