發(fā)酵環(huán)境變化對(duì)酵母生長(zhǎng)和成品啤酒的影響

崔云前，吳梓萌，蘇文超，張海夢(mèng)

（齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353）

啤酒是人類(lèi)古老的酒精飲料，歷史悠久，隨著科學(xué)技術(shù)的提高以及人們對(duì)啤酒工藝的不斷探求，釀酒師們已經(jīng)掌握了啤酒發(fā)酵過(guò)程的生化機(jī)理，但酵母代謝過(guò)程復(fù)雜并且發(fā)酵過(guò)程中可以改變的工藝參數(shù)眾多，如麥汁濃度、發(fā)酵溫度設(shè)置、壓力參數(shù)等。啤酒發(fā)酵過(guò)程中采取的釀造工藝將直接或間接影響到成品啤酒中的高級(jí)醇、酯、雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)。所以了解啤酒發(fā)酵過(guò)程中的變量因素，優(yōu)化酵母的生長(zhǎng)環(huán)境，可以有效控制發(fā)酵進(jìn)程，本文選取了幾個(gè)主要的變量因素，對(duì)現(xiàn)有的研究進(jìn)行了綜述，以期為啤酒工業(yè)生產(chǎn)提供理論參考。

1 麥汁濃度

麥汁營(yíng)養(yǎng)成分豐富，為酵母細(xì)胞提供了良好的生存環(huán)境，糖類(lèi)物質(zhì)約占麥汁浸出物的90%，酵母利用麥汁中的可發(fā)酵糖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乙醇和二氧化碳，同時(shí)形成一系列發(fā)酵副產(chǎn)物，如醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)和硫化物等物質(zhì)[1]。酵母進(jìn)行有氧呼吸，麥汁中糖度快速下降，酵母生長(zhǎng)繁殖結(jié)束后，糖度下降趨勢(shì)呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，有研究發(fā)現(xiàn)[2]，初始糖度12°P的麥汁，啤酒主發(fā)酵周期為4～6 d，發(fā)酵完成后的小麥主發(fā)酵液糖度值為4～5°P。

1.1 滲透壓力

當(dāng)酵母接種到一定濃度的麥汁后，會(huì)受到滲透壓力，滲透壓是在由半透膜隔開(kāi)兩種濃度不同的溶質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的力。酵母細(xì)胞可以根據(jù)滲透壓力改變自身體積的大小，在高滲環(huán)境下，減少細(xì)胞體積；在低滲環(huán)境下，增加細(xì)胞體積。PRATT P L等[3]將酵母暴露于20 g/100 mL的山梨糖醇溶液15 min后，利用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，與對(duì)照組表面光滑的酵母細(xì)胞相比，處理過(guò)的酵母細(xì)胞發(fā)生收縮，存在外包膜的褶皺和內(nèi)陷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)愛(ài)爾菌株釀酒酵母（Sac charomyces cerevisiae）、比拉格菌株巴斯德酵母（Saccha romyces pastorianus）對(duì)滲透脅迫的耐受性更大。ZHUANG S W等[4]提出，隨著麥汁濃度增加，酵母細(xì)胞膜流動(dòng)性受到影響，為了應(yīng)對(duì)滲透壓力的改變，會(huì)產(chǎn)生丙三醇和海藻糖，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)可溶性酶并且對(duì)細(xì)胞膜穩(wěn)定性起作用。

麥汁滲透壓隨著稀釋原麥汁濃度而降低，但乙醇和丙三醇的滲透壓在較高濃度下會(huì)增加，因此乙醇是發(fā)酵過(guò)程中影響滲透壓的主要因素。

1.2 乙醇脅迫

以初始糖度為18°P的麥汁為典型，得到的成品啤酒中含7.5%vol的酒精。先前的研究表明[5]，應(yīng)用高濃度釀造技術(shù)釀造傳統(tǒng)的渾濁啤酒（opaque beer）時(shí)，啤酒中的酒精濃度為4.74%vol，與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下記錄的產(chǎn)酒精濃度相比，高出了2.66%vol。根據(jù)ERTEN H等[6]的研究，利用高濃度麥汁進(jìn)行釀造時(shí)，每單位的可發(fā)酵浸出物產(chǎn)生更多的乙醇，這個(gè)工藝需要使用無(wú)氧水進(jìn)行下游稀釋步驟來(lái)調(diào)節(jié)成品啤酒中浸出物/乙醇的含量[7]。

因此，使用高濃度麥汁進(jìn)行釀造時(shí)，應(yīng)定期監(jiān)控乙醇含量[8]，乙醇含量較高，應(yīng)相應(yīng)地補(bǔ)充發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)條件，如金屬離子（鋅、鎂、鈣）、脂質(zhì)和酵母營(yíng)養(yǎng)[9]。

1.3 麥汁濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)和成品啤酒的影響及解決措施

在過(guò)去50年左右的時(shí)間里，提高釀造和蒸餾的效率已經(jīng)成為釀造和蒸餾行業(yè)的一個(gè)主要焦點(diǎn)[8]?？梢蕴岣呱a(chǎn)效率的高濃釀造順勢(shì)而生，高濃度釀造是利用高于標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥汁進(jìn)行釀造，為了增強(qiáng)啤酒的穩(wěn)定性，后期用去氧水對(duì)啤酒進(jìn)行稀釋處理[10]。通過(guò)這種方式，提高了生產(chǎn)需求，節(jié)省能源，而不會(huì)從根本上擴(kuò)大釀造、發(fā)酵和貯存設(shè)備，啤酒口味更加順滑[6]。

JANE M M等[11]選取12～20°P的麥汁進(jìn)行啤酒釀造，發(fā)現(xiàn)與正常濃度的麥汁（12°P）相比，發(fā)酵96 h后，高濃度釀造時(shí)的殘余可溶性固形物含量較高，會(huì)導(dǎo)致啤酒中有不可接受的甜味。高濃度釀造啤酒仍然存在的問(wèn)題是啤酒泡沫穩(wěn)定性不好，STEWART G G[12]對(duì)20°P與10°P麥汁進(jìn)行研究，從滿鍋麥汁到成品啤酒，監(jiān)測(cè)其中的疏水性多肽，發(fā)現(xiàn)高濃度麥汁（20°P）在發(fā)酵過(guò)程中大量損失疏水性多肽，發(fā)酵結(jié)束只有50 mg/L，將高濃度釀造得到的啤酒稀釋至酒精含量4.5%vol，疏水性多肽含量不到低濃度啤酒（10°P）的50%。

高濃度麥汁釀造時(shí)產(chǎn)生的酯類(lèi)含量更高，主要為乙酸乙酯和乙酸異戊酯，這與LIMA L等[7，13-14]的研究結(jié)果一致，啤酒中的果香和丁香花味更突出。利用高濃度麥汁進(jìn)行釀造時(shí)，采取分批通風(fēng)，接種酵母時(shí)增加麥汁中的溶解氧含量，促進(jìn)了酵母生長(zhǎng)，一定程度上降低了酯含量[15]。發(fā)酵溫度也可以加速高濃度發(fā)酵，LIMA L等[7]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)溫度增加至18 ℃，酵母接種率增加至22×106CFU/mL，可以使22°P和15°P的麥汁發(fā)酵時(shí)間相同。STEWART G G[8]提出，當(dāng)酵母接種到高濃度麥汁（＞16°P）后，利用亞甲基藍(lán)染液對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行活力鑒定，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞活力下降，這與ZHUANG S W等[4]的研究結(jié)果一致。酵母長(zhǎng)期處于高濃度乙醇、CO2和不同濃度滲透壓的環(huán)境中，對(duì)酵母有毒害作用[16]，使酵母的生長(zhǎng)代謝受到抑制，酵母使用代數(shù)明顯降低，這與PRATT P L等[3，17]的研究結(jié)果一致。高濃釀造中補(bǔ)充8種氨基酸（蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸）可以顯著提高麥汁發(fā)酵度，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)[18]。

此外，麥汁濃度是影響發(fā)酵度的關(guān)鍵因素，發(fā)酵度是酵母消耗麥汁中浸出物的量與原麥汁浸出物總量的比值。釀造高發(fā)酵度（70%以上）的啤酒時(shí)，麥汁濃度越低，乙醇生成量減少，感官品評(píng)后發(fā)現(xiàn)啤酒口味越寡淡，風(fēng)味物質(zhì)生成量減少[19]。在現(xiàn)代啤酒廠，通過(guò)發(fā)酵高濃度麥汁來(lái)縮短發(fā)酵時(shí)間并且增加產(chǎn)量，麥汁濃度高低對(duì)酵母吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并進(jìn)行生長(zhǎng)代謝都具有重要影響[20]。

2 接種率對(duì)酵母生長(zhǎng)和成品啤酒的影響

酵母接種率對(duì)發(fā)酵速度影響極大，需根據(jù)酵母種類(lèi)、麥汁濃度、發(fā)酵溫度等因素來(lái)確定，以添加酵母后使麥汁快速起發(fā)為準(zhǔn)[15]。傳統(tǒng)啤酒廠發(fā)酵時(shí)正常酵母接種率為20×106CFU/mL。

VERBELEN P J等[21]在實(shí)驗(yàn)室條件下將拉格菌株接種到15°P麥汁中，發(fā)現(xiàn)2～3代酵母發(fā)酵時(shí)，將酵母接種率增加4倍可以縮短發(fā)酵時(shí)間，這是因?yàn)楦呓臃N率比起正常接種率的細(xì)胞，初始階段細(xì)胞密度高所以對(duì)發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，發(fā)酵時(shí)間縮短[22]。增加接種率，發(fā)酵旺盛，酵母吸收氨基酸能力增強(qiáng)，形成有機(jī)酸和CO2以及酵母細(xì)胞分泌H+多，得到的成品啤酒中pH較低[22]。

RODMAN A D等[23]對(duì)啤酒釀造過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)仿真與可視化分析，發(fā)現(xiàn)接種率較低會(huì)引起發(fā)酵副產(chǎn)物雙乙酰和乙酸乙酯濃度較高，VERBELEN P J等[22]提出，隨著發(fā)酵進(jìn)行，任何酵母接種率下檢測(cè)到的雙乙酰含量都是升高的，當(dāng)可發(fā)酵糖消耗50%以后，接種率為1×107～2×107CFU/mL時(shí)，檢測(cè)到雙乙酰含量開(kāi)始下降，但接種率為4×107～12×107CFU/mL時(shí)，產(chǎn)生雙乙酰一直在增多，僅在糖消耗70%～80%后才呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。酵母發(fā)酵2代后，接種率正常的酵母細(xì)胞，啤酒中雙乙酰維持在穩(wěn)定值（0.26 mg/L），接種率高，啤酒中雙乙酰含量比較高，但對(duì)酵母進(jìn)行充氧，可有效減少啤酒中雙乙酰含量[21]。KUCHARCZYK K等[14]提出接種量（5×106～7×106CFU/mL）較低時(shí)，改變酵母接種率對(duì)整個(gè)工藝中乙醛的平均含量沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)影響，當(dāng)麥汁中酵母接種量從7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，乙醛濃度發(fā)生了可比較的降低，VERBELEN P J等[22]也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。對(duì)于1代酵母，接種率高產(chǎn)生的高級(jí)醇含量較多，主要是異丁醇和異戊醇濃度增加，而隨著酵母使用代數(shù)增加，接種率高低產(chǎn)生高級(jí)醇含量差異不明顯[21]。酵母接種率不同，細(xì)胞凈生長(zhǎng)量（最多酵母細(xì)胞數(shù)與最初接種率的差值）不同，但乙醇產(chǎn)量是相同的，這與RODMAN A D等[23]的研究一致，但劉麗艷[24]研究提出，接種率較高乙醇產(chǎn)生較多。VERBELEN P J等[21]提出與正常酵母接種率相比，接種率提高4倍對(duì)乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯有消極影響。乙酸異戊酯在接種率為40×106CFU/mL時(shí)有最大生成量，己酸乙酯沒(méi)有明顯產(chǎn)量趨勢(shì)[22]。酵母接種率從5×106CFU/mL增加至7×106CFU/mL乙酸乙酯的生成量沒(méi)有改變，但是接種量進(jìn)一步增加，從7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，酯濃度顯著增加了10%[14]。

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)較高接種率（20×106～120×106CFU/mL）比起較低接種率（10×106CFU/mL），酵母細(xì)胞活力顯著下降，表明發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞活力有消極影響[22]，VERBELEN P J等[21]的研究也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。

在高接種率發(fā)酵時(shí)，酵母細(xì)胞的凈生長(zhǎng)量下降，對(duì)接下來(lái)幾代酵母的生理學(xué)穩(wěn)定性有不利影響。因此，需要應(yīng)用不同的O2條件，如麥汁充氧和對(duì)發(fā)酵液充氧，這對(duì)酵母生理和高細(xì)胞密度發(fā)酵下啤酒風(fēng)味物質(zhì)的穩(wěn)定至關(guān)重要。

3 發(fā)酵溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)和成品啤酒的影響

發(fā)酵過(guò)程的溫度會(huì)嚴(yán)重影響酵母生長(zhǎng)和代謝速率，隨著發(fā)酵開(kāi)始，需要隨時(shí)監(jiān)控發(fā)酵罐內(nèi)的溫度，在加速發(fā)酵的同時(shí)確保酵母特性沒(méi)有改變并且發(fā)酵副產(chǎn)物的產(chǎn)量不會(huì)損害成品啤酒的風(fēng)味。麥汁開(kāi)始發(fā)酵之前，需要保證滿罐溫度和發(fā)酵開(kāi)始的溫度一致，一般麥汁的滿罐溫度比主發(fā)酵溫度低3～4 ℃[25]。

拉格菌株發(fā)酵溫度在6～15 ℃，發(fā)酵時(shí)間大約在一周（160 h）；愛(ài)爾菌株發(fā)酵溫度較高在18～25 ℃，發(fā)酵時(shí)間較短為3～4 d。比起拉格菌株，愛(ài)爾菌株的代謝狀態(tài)對(duì)溫度變化更敏感，一般發(fā)酵溫度較高會(huì)加快麥汁中可發(fā)酵糖的消耗率，游離氨基氮含量會(huì)增多，促進(jìn)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，減少發(fā)酵時(shí)間并增加啤酒生產(chǎn)效率；溫度較低可以防止細(xì)菌污染并賦予啤酒獨(dú)特的口感和香氣，但會(huì)導(dǎo)致酵母發(fā)酵活力降低[26]。為了應(yīng)對(duì)發(fā)酵溫度的變化，酵母細(xì)胞會(huì)快速地調(diào)整自身的代謝狀態(tài)[27]，改變酵母生長(zhǎng)率、發(fā)酵速率并形成代謝物。RODMAN A D等[23]提出，發(fā)酵過(guò)程中的溫度會(huì)嚴(yán)重影響酵母生長(zhǎng)和代謝速率，只要發(fā)酵環(huán)境維持在30 ℃以下并且酵母細(xì)胞不受損害，溫度越高發(fā)酵速度越快。超過(guò)這個(gè)臨界溫度，酒精和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)產(chǎn)生不受歡迎的物質(zhì)，細(xì)菌生長(zhǎng)增加。

當(dāng)原麥汁濃度相同時(shí)，主發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵速度影響較大，主發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵速度越快[28]。YU Z M等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度從15 ℃變化至10 ℃時(shí)，拉格菌株和愛(ài)爾菌株的發(fā)酵時(shí)間分別延長(zhǎng)了33.33%和100%，發(fā)酵溫度較低，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等糖代謝活力降低，糖酵解關(guān)鍵酶如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的最大反應(yīng)速率下降，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖變得遲緩。提高發(fā)酵溫度，酵母生長(zhǎng)繁殖加快，高級(jí)醇生成增加，特別是芳香醇，如β-苯乙醇、酪醇、色醇[15]。高溫發(fā)酵對(duì)酯形成有利，當(dāng)發(fā)酵溫度從12.5 ℃升至25 ℃，乙酸乙酯濃度增加了60%，乙酸異戊酯增加30%[15]。發(fā)酵溫度為17～22 ℃，20 ℃時(shí)啤酒穩(wěn)定性和品質(zhì)較好[24]，WEBERSINKE F等[29]也提出，在20 ℃進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，水果香氣、酒精、酸度和酒體呈現(xiàn)最佳值，硫味和腐敗味最淡。

在發(fā)酵過(guò)程中要保證麥汁發(fā)酵溫度始終如一，只有穩(wěn)定的發(fā)酵溫度才能確保酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵速度一致。

4 壓力對(duì)酵母生長(zhǎng)和成品啤酒的影響

在啤酒釀造過(guò)程中，酵母菌株懸浮在發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵活動(dòng)，在發(fā)酵結(jié)束后，酵母菌株遵循自身獨(dú)特的釀造特性，拉格菌株絮凝物沉積到錐形發(fā)酵罐錐底[30]，從錐底排出酵母進(jìn)行回收；愛(ài)爾菌株的絮凝物與CO2結(jié)合上升到啤酒表面[31]，國(guó)外的發(fā)酵罐多為敞口發(fā)酵罐，可在啤酒表面進(jìn)行回收，但國(guó)內(nèi)發(fā)酵罐多為封閉式發(fā)酵罐，回收愛(ài)爾菌株時(shí)多在降溫后絮凝物沉積到錐底進(jìn)行回收。在啤酒工業(yè)生產(chǎn)中，啤酒發(fā)酵罐的體積較大，加上液位壓差和發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的CO2，同一發(fā)酵罐中不同部位的酵母受到的壓力不同。對(duì)于大型發(fā)酵罐來(lái)說(shuō)，罐內(nèi)壓力有時(shí)可達(dá)0.3 MPa[32]。

一般來(lái)說(shuō)，最高控制罐壓為發(fā)酵溫度除以100，罐壓越高，啤酒中溶解CO2越多。在發(fā)酵過(guò)程中，增加麥汁高度會(huì)加大靜止液壓，CO2濃度增加，酵母生長(zhǎng)繁殖受到影響，發(fā)酵速率降低，壓力上升也會(huì)抑制酯和高級(jí)醇的生成，所以保持一定高度的麥汁很有必要[25]。對(duì)比常壓（0.1 MPa）培養(yǎng)的酵母，加壓培養(yǎng)（0.3 MPa、0.5 MPa、1.0 MPa）酵母到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間推后，持續(xù)時(shí)間會(huì)縮短，并且衰亡期會(huì)提前到來(lái)，酵母產(chǎn)二甲基硫的能力下降，雙乙酰合成和還原都受到影響[32]，啤酒中絕大多數(shù)的揮發(fā)酯和高級(jí)醇都是在主發(fā)酵期間形成，乙醛作為乙醇的前體物質(zhì)，在主發(fā)酵前期大量產(chǎn)生[15]，酵母細(xì)胞受到一定壓力，細(xì)胞內(nèi)各種酶活力會(huì)下降，抑制酯類(lèi)物質(zhì)和高級(jí)醇的代謝，揮發(fā)酯和高級(jí)醇生成量會(huì)減少，乙醇脫氫酶活力下降造成乙醛不能被還原為乙醇[33]，成品啤酒中乙醛含量超過(guò)閾值。另有研究[34]指出，保持一定壓力發(fā)酵對(duì)酵母增殖有積極作用，可以降低發(fā)酵液中蛋白酶A含量，從而減少啤酒中泡沫活性蛋白的降解，可以促進(jìn)啤酒維持一定的泡持性。

發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的壓力會(huì)影響酵母的正常代謝活動(dòng)，酶代謝能力下降，影響揮發(fā)性風(fēng)物物質(zhì)的生成和還原，最終影響成品啤酒的風(fēng)味。但是，隨著人們追求生產(chǎn)效率，發(fā)酵設(shè)備逐漸變得大型化，壓力將是人們不可忽視的影響因素之一。

5 結(jié)論

在實(shí)際生產(chǎn)釀造中，應(yīng)不斷調(diào)整工藝，根據(jù)啤酒廠定義的產(chǎn)品目標(biāo)，對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行有效控制，可以通過(guò)犧牲低優(yōu)先級(jí)的工藝目的提高發(fā)酵效率，如適當(dāng)提高發(fā)酵溫度，在縮短發(fā)酵時(shí)間的同時(shí)卻適度降低了乙醇含量和乙酸乙酯濃度，并在可容許范圍內(nèi)增加了雙乙酰濃度[35]；隨著麥汁濃度的增加，有必要成比例地增加酵母接種率[10]并優(yōu)化溫度條件；發(fā)酵罐罐壓會(huì)影響酵母的狀態(tài)和活力，外觀發(fā)酵度70%以上，適當(dāng)增加發(fā)酵罐罐壓（0.10 MPa升至0.14 MPa），雙乙酰還原加快[36]。此外，也應(yīng)該根據(jù)啤酒自身發(fā)酵特點(diǎn)選育合適的酵母。