膠乳增強(qiáng)免疫比濁法尿微量白蛋白雙試劑盒的研究及性能分析

曲怡蓉 王學(xué)亮 韓玉環(huán) 王華麗 山東藥品食品職業(yè)學(xué)院藥品研發(fā)中心 （山東 威海 264210）

內(nèi)容提要： 目的：利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法研究測定尿微量白蛋白的雙試劑，并進(jìn)行性能評價(jià)。方法：選用不同批次產(chǎn)品，分別在OLYMPUS AU2700、羅氏C501、邁瑞 BS-800生化分析儀上設(shè)置項(xiàng)目參數(shù)并進(jìn)行檢測校準(zhǔn)；方法學(xué)評價(jià)包括準(zhǔn)確度、分析靈敏度、精密度、線性范圍等性能指標(biāo)。結(jié)果：該試劑盒檢測準(zhǔn)確度符合要求。用試劑盒測試15.5mg/L尿微量白蛋白時(shí)，靈敏度變化均大于0.010，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。低值樣本S低和高值樣本S高批內(nèi)精密度結(jié)果CV≤4.0%，批間精密度≤10.0%，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。線性范圍（0.3～200.0mg/L）符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論：新研究的雙試劑盒在一般全自動生化分析儀上性能能夠滿足臨床尿微量白蛋白檢測。

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，隨著糖尿病患者的病情加重，糖尿病腎病患者的發(fā)病率也越來越高，大約有30%的糖尿病患者患有糖尿病腎病，患者的健康受到了極大的危害[1]。測定尿微量白蛋白是一靈敏、簡便、快速的檢查方法，對早期腎損害的診斷遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)定性或半定量試驗(yàn)，依據(jù)診斷結(jié)果給予特定人群相應(yīng)的早期治療，避免或減少了以后進(jìn)行的透析和一些昂貴的末期治療，因此在臨床檢驗(yàn)中廣泛應(yīng)用[2]。目前，尿微量白蛋白測定方法主要采用膠體金法、免疫比濁法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法[3]。本試劑盒采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，下面就利用此法研發(fā)的雙試劑盒測定尿微量白蛋白的產(chǎn)品性能進(jìn)行分析及評價(jià)。

此次研發(fā)體外診斷試劑盒的相關(guān)技術(shù)資料遵循《GB/T 26124-2011臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）》[4]的要求，制定的本試劑的分析性能。

1.材料與方法

1.1 材料

參照EP9-A2文件[5]，采用不少于40份在檢測濃度范圍內(nèi)不同濃度的人源樣本、純化水、15.5mg/L樣本。儀器采用三種不同品牌型號的全自動生化分析儀，分別為OLYMPUS AU2700、羅氏C501、邁瑞 BS-800，儀器保證運(yùn)行正常；選用三批試劑（批號：20180726、20180727、20180728）對樣本進(jìn)行檢測[6]。

1.2 方法

1.2.1 準(zhǔn)確度評價(jià)

準(zhǔn)確度的檢測采用對比試驗(yàn)，參照EP9-A2，用不少于40份在檢測濃度范圍內(nèi)不同濃度的人源樣本，以生產(chǎn)企業(yè)指定的分析系統(tǒng)作為對比方法，以已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑，每個(gè)樣本測定一次。用線性回歸方法計(jì)算兩組結(jié)果的相關(guān)系數(shù)及每個(gè)濃度點(diǎn)的相對偏差，其中，0.3～15.0mg/L范圍內(nèi)計(jì)算實(shí)測濃度與估計(jì)值的絕對偏差；在15.0～200.0mg/L計(jì)算實(shí)測濃度與估計(jì)值的相對偏差。

1.2.2 分析靈敏度評價(jià)

依照儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和相應(yīng)的測量程序?qū)σ阎獫舛葹?5.5mg/L樣本，使用每個(gè)批號的試劑在每臺設(shè)備上各測試兩次。

1.2.3 精密度評價(jià)

參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）[7]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，每天做2個(gè)批次的測試，每批測試時(shí)，對同一樣品作雙份測量，連續(xù)做20d。評估結(jié)束時(shí)每臺設(shè)備共有40對，即80個(gè)測試結(jié)果。從40批次測量中雙份結(jié)果的差值求出批內(nèi)精密度。從所有80個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算出批間精密度。

1.2.4 線性范圍評價(jià)

取三批試劑用接近線性范圍上限的高濃度樣品（200mg/L）和接近線性范圍下限的低濃度樣品（0.3mg/L），混合成6個(gè)稀釋濃度（X），分別測試試劑（盒），每個(gè)稀釋梯度測定3次，分別求出測定結(jié)果的均值（Y）。以稀釋濃度（X）為自變量，以測定結(jié)果均值（Y）為因變量求出線性回歸方程。計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r，若r≥0.990，0.3～15.0mg/L范圍內(nèi)，測定的絕對偏差不超過±1.8mg/L，在15.0～200.0mg/L范圍內(nèi)，測定的相對偏差不超過±10%，則線性范圍符合要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度

結(jié)果可見，用三批待測試劑及對比試劑分別測定40份在檢測濃度范圍內(nèi)不同濃度的人源樣本。尿微量白蛋白測定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）的準(zhǔn)確度指標(biāo)定為：在0.3～200.0mg/L區(qū)間內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990。在0.3～15.0mg/L范圍內(nèi)測定的絕對偏差≤±1.8mg/L，在15.0～200.0mg/L范圍內(nèi)測定的相對偏差≤±10%，則符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

表1. 不同批號靈敏度值

表2. 批內(nèi)精密度結(jié)果

表3. 回歸方程

2.2 分析靈敏度

由表1可見，用試劑盒測試15.5mg/L尿微量白蛋白時(shí)，靈敏度變化均大于0.010，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 精密度

低值樣本S低和高值樣本S高批內(nèi)精密度結(jié)果如表2都≤4.0%，批間精密度S低為6.0%、6.3%、5.8%，S高為3.4%、2.4%、2.5%，滿足批內(nèi)精密度≤4.0%，批間精密度≤10.0%要求，表明該性能能滿足臨床應(yīng)用要求。

2.4 線性范圍

在0.3～200.0mg/L區(qū)間內(nèi)，經(jīng)驗(yàn)證線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990，且在0.3～15.0mg/L范圍內(nèi)測定的絕對偏差≤±1.8mg/L，在15.0～200.0mg/L范圍內(nèi)測定的相對偏差≤±10%，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。見表3。

3.討論

該試劑盒采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，將樣本中的尿微量白蛋白與試劑中的抗人白蛋白抗體膠乳顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)，凝集反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物而產(chǎn)生濁度，其濁度高低在一定量抗體存在時(shí)與樣品中白蛋白成正比。通過測定特定波長的吸光度值570nm，參照校準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出尿液中白蛋白的含量?？贵w與膠乳顆粒偶聯(lián)后進(jìn)行質(zhì)量檢測，符合企業(yè)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（配制尿微量白蛋白測定試劑，配制的試劑應(yīng)符合技術(shù)要求的規(guī)定）。市場上有采用的膠體金法研究的試劑，雖然檢測速度快，可準(zhǔn)確做到床旁快檢，單份試劑檢測，需樣本量少優(yōu)點(diǎn)，但易受干擾，重復(fù)性、精密度和特異性較差[8]。采用的免疫比濁法研究的試劑是以測定溶液對光散射程度，其基本原理是一定波長的光沿水平軸照射，當(dāng)碰到免疫復(fù)合物后將可導(dǎo)致光線的散射，抗原抗體復(fù)合物的形成速率與光的散射強(qiáng)度成正比，同時(shí)這種方法還具有動態(tài)測定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)效率。根據(jù)這個(gè)原理進(jìn)行MALB檢測，同樣可以準(zhǔn)確、快速的檢測出結(jié)果[9]。但此種方法成本較高，配制較復(fù)雜。采用的化學(xué)發(fā)光法檢測研究的試劑雖然操作方便、結(jié)果穩(wěn)定，少量樣本檢測時(shí)相對簡便快速，不適用于大量樣本，另外，化學(xué)發(fā)光法成本較高，還有因出現(xiàn)故障而浪費(fèi)可測試的數(shù)量，增加了檢測成本[10]。采用的酶聯(lián)免疫法檢測研究的試劑應(yīng)用廣泛，并且檢測速度快、費(fèi)用低、儀器操作簡單，可用于現(xiàn)場檢驗(yàn)[11]。但是酶聯(lián)免疫法操作過程繁瑣，不能做定量檢測，且特異性和靈敏性較差。綜上方法特點(diǎn)，利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法研究改良的試劑盒具有成本低、檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢，其準(zhǔn)確度、分析靈敏度、重復(fù)性、精密度、線性范圍均符合行業(yè)要求，該試劑盒能夠滿足應(yīng)用廣泛的OLYMPUS AU2700、羅氏C501、邁瑞 BS-800全自動生化分析儀上臨床檢驗(yàn)要求。