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      鴨甲型肝炎病毒的遺傳和抗原穩(wěn)定性分析

      2019-01-14 05:35:06馬秀麗李玉峰于可響劉存霞亓麗紅宋敏訓(xùn)
      中國動物傳染病學(xué)報 2018年6期
      關(guān)鍵詞:中和毒株分支

      馬秀麗,黃 兵,李玉峰,于可響,劉存霞,胡 峰,亓麗紅,宋敏訓(xùn),艾 武

      (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省禽病診斷與免疫重點實驗室,濟南 250023)

      鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)歸屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒屬,DHAV主要危害3周齡以下的雛鴨,死亡率高達80%以上,給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大危害[1]。DHAV包括三個血清型,即DHAV-1,DHAV-2和DHAV-3[2]。DHAV-1的危害普遍存在于全國各地,近年來,DHAV-3的流行有增加的趨勢,個別鴨場還會出現(xiàn)DHAV-1和DHAV-3混合感染的現(xiàn)象,而DHAV-2僅在臺灣發(fā)生過[3]。三者均具有典型小RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu),但三者之間存在顯著的序列差異,遺傳進化關(guān)系表明三者屬于三個不同的基因型,即基因A型、基因B型和基因C型,血清學(xué)試驗證明三者之間無交叉反應(yīng)[4,5]。隨著DHAV-1和DHAV-3的危害日趨嚴重[6-15],該病的遺傳變異和抗原穩(wěn)定性備受大家的關(guān)注。為進一步分析當前DHAV的流行特點和變異現(xiàn)狀,本研究對本實驗室保存的25株DHAV-1(2000年~2017年)和32株DHAV-3(2008年~2017年)以及Genbank中下載的DHAV代表株的VP1基因進行了生物信息學(xué)分析,結(jié)合代表毒株的生物學(xué)特性,進一步揭示了DHAV-1和DHAV-3的抗原特性和變異情況,對我國今后鴨甲型肝炎病毒的綜合防控具有重要的指導(dǎo)意義。

      1 材料與方法

      1.1 DHAV毒株和陽性血清本實驗室分離保存的25株DHAV-1(表1)和32株DHAV-3(表2)均由本實驗室分離保存;1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和1-HC5/13單因子陽性血清由本實驗室制備并保存。

      表1 DHAV-1毒株背景Table1 DHAV-1 strains used in this study

      (續(xù)上表)

      表2 收集的DHAV-3毒株背景Table2 Summary of DHAV-3 strains used in this study

      1.2 DHAV VP1基因的擴增參考Genbank中已發(fā)表的DHAV-1和DHAV-3 VP1基因序列,分別設(shè)計1對擴增DHAV-1、DHAV-3VP1基因異性引物。DHAV-1-F:5'- CTCGAGGGTGATTCTAACC AGTT-3',DHAV-1-R:5'-GCGGCCGCTTCA ATTTCCAGATT- 3'(下劃線堿基為酶切位點);DHAV-3-F:5'- CTCGAGGGTGATTCCAATC AGCT- 3',DHAV-3-R:5'- GCGGCCGCTTC AATYTCCARAT- 3'(下劃線堿基為酶切位點)。采用Trizol方法提取病毒RNA后,按常規(guī)RT-PCR方法擴增DHAV毒株的VP1基因,并將回收的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中,雙酶切法篩選出陽性重組子,送北京博尚生物有限公司進行VP1基因序列測定。

      1.3 DHAV VP1蛋白的遺傳進化分析采用MEGA6.0軟件對測定的DHAV毒株與Genbank中下載的VP1基因(表3)的核苷酸和氨基酸序列進行比較,用Boot-strap法(Replication值為1000)計算遺傳距離并繪制N-J進化樹,分析當前國內(nèi)DHAV的流行情況及不同毒株氨基酸的變異程度。

      表3 Genbank中下載的DHAV-1和DHAV-3序列Table 3 Reference sequences of DHAV-1 and DHAV-3 from Genbank

      1.4 血清交叉中和試驗采用固定病毒稀釋血清方法進行交叉中和試驗。將自制的1-CL/03、1-HA5/13或3-FX/08、3-HC5/13單因子血清分別與等體積的病毒含量為200ELD50/0.1mL的DHAV代表毒株(2016年和2017年)混合,充分作用后分別接種非免鴨胚,37℃溫箱培養(yǎng),記錄結(jié)果,用Reed和Muench兩氏法計算血清中和指數(shù)。

      2 結(jié)果

      2.1 DHAV VP1基因的序列分析對實驗室DHAV-1、DHAV-3毒株的VP1基因序列分析發(fā)現(xiàn),DHAV-1間的VP1基因的核苷酸序列相似性為91.7%~99.9%;DHAV-3間的VP1基因的核苷酸序列相似性為90.7%~99.6%;DHAV-1和DHAV-3間的VP1基因核苷酸序列相似性為70.0%~73.5%;因此VP1蛋白序列同源性在DHAV分型上起主要作用。DHAV-1和DHAV-3的VP1存在一些氨基酸變異位點,主要集中在143~147位,171~201位,204~212和217~224位。氨基酸變異位點的存在導(dǎo)致了DHAV-1和DHAV-3抗原性的差異,從而使得DHAV-1與DHAV-3的交叉反應(yīng)性很低或無交叉中和反應(yīng)[3,5]。選取DHAV-1代表株1-CL/03和1-HA5/13,與1-JSDH/16、1-HZYC/16和1-GD/17分離毒株之間比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在5處氨基酸位點的改變(181位、184位、193位、219位和238位)。選取DHAV-3代表株3-FX/08和3-HC5/13,與2016 ~2017年DHAV-3分離毒株進行比較,發(fā)現(xiàn)存在9處氨基酸位點的改變(21位、48位、159位、188位、195位,196位、205位、239位和240位),結(jié)合血清中和試驗結(jié)果,表明這些氨基酸位點的改變沒有影響DHAV-1或DHAV-3的中和特性。

      2.2 遺傳進化分析根據(jù)繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,DHAV-1進化為兩個大分支(圖1),一個分支為2013年以前的分離毒株,另一分支為近幾年的分離毒,其中2013年的分離毒1-HA5/13也分布在這個分支上,表明2016~2017年分離毒與1-HA5/13遺傳距離較近。DHAV-3也進化為2個大分支(圖2),一個分支為經(jīng)典的毒株3-AP04114/03、3-B63/08和3-NC/09,另一個分支為實驗室2008~2017年分離毒株和福建分離毒株3-G/99,其中實驗室分離毒又進化為一單獨的亞分支。

      2.3 DHAV血清交叉中和試驗由圖3可見,3株DHAV-1分離株(1-JSDH/16、1-HZYC/16、1-GD/17)針對1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指數(shù)均在100以上,均可判為陽性。3株分離毒與1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指數(shù)差異較大,可能與這2份血清自身效價差異較大有關(guān)。由圖4可見,10株DHAV-3分離株針對3-FX/08和3-HC5/13血清的中和指數(shù)均在100以上,均可判為陽性,表明各毒株之間有較好的交叉反應(yīng)。

      圖1 DHAV-1遺傳進化關(guān)系分析Fig.1 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-1

      圖2 DHAV-3遺傳進化關(guān)系分析Fig.2 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-3

      圖3 1-CL/03和1-HA5/13針對DHAV-1不同毒株的中和指數(shù)Fig. 3 Neutralization index of different DHAV-1 strains against serum 1-CL/03 and 1-HA5/13

      圖4 3-FX/08和3-HC5/13針對DHAV-3不同毒株的中和指數(shù)Fig. 4 Neutralization index of different DHAV-3 strains against serum 3-FX/08 and 3-HC5/13

      3 討論

      3.1 DHAV遺傳進化分析本文根據(jù)DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的遺傳進化分析發(fā)現(xiàn),在過去16年內(nèi),DHAV-1進化為兩個主要分支,分支1a包括2000~2013年流行的20個毒株,另一個分支1b包括2013~2017年流行的5個毒株。我們又進一步分析這兩個分支上DHAV-1的地理分布差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),來源于同一地區(qū)的毒株在兩個分支中均存在,這可能與當前家禽頻繁的貿(mào)易往來有較大關(guān)系。過去8年內(nèi)DHAV-3進化為兩個遺傳分支,其中分支3b只有2003~2009年分離的3個毒株,1個毒株來自韓國(3-AP04114/03),1個毒株來自越南(3-NC/09),1個毒株來自中國北京(3-B63/08)。另一個分支3a為本研究中分離的DHAV-3毒株與福建毒株3-G/99,DHAV-3分離毒株占據(jù)單獨的一個亞分支,有趣的是這些毒株又進一步分化成更小的亞分支,其中2012-2017年的大多數(shù)毒株集中在一個亞分支上。另一個亞分支上只有福建毒株3-G/99,由此可見我國早在1999年就有DHAV-3的存在。DHAV-3毒株之間無明顯的地理分布差異。

      3.2 DHAV-1和DHAV-3的血清學(xué)特征我們選取DHAV-1和DHAV-3兩個分支上的代表毒株制備的陽性血清1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和3-HC5/13,分別與近兩年分離的DHAV-1和DHAV-3毒株進行血清交叉中和試驗,其主要目的是分析DHAV遺傳多樣性對抗原性的影響。結(jié)果表明,過去16年的DHAV-1和8年的DHAV-3的抗原性相對穩(wěn)定,相同血清型之間有很好的交叉保護,DHAV疫苗仍能中和當前流行的相同血清型的DHAV毒株,說明現(xiàn)有DHAV疫苗完全能夠保護相同血清型的DHAV的感染。

      總之,在過去16年中,DHAV的遺傳性和抗原性相對穩(wěn)定。盡管DHAV-3的進化速度遠快于DHAV-1[16],目前來看DHAV-3的高進化速率并未造成該血清型病毒抗原性的改變。但上述研究結(jié)果提示我們應(yīng)做好DHAV的流行病學(xué)監(jiān)測,防止?jié)撛诘倪z傳變異導(dǎo)致病毒逃逸而引發(fā)疫病的暴發(fā)和流行。

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