1株寬噬菌譜腸出血性大腸桿菌噬菌體的分離及生物學特性分析

孫利廠，周 艷，張莉莉，龐茂達，何 濤，包紅朵，張 輝，何靈塵，王 冉

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標準重點實驗室 江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點實驗室，南京210014）

腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga-toxin producingEscherichia coli，STEC）的一類亞群，1982年被證實是一種重要的人畜共患病原菌[1]。EHEC廣泛分布于自然界的土壤、水和農(nóng)產(chǎn)品及林產(chǎn)品中，常定植在人和動物的腸道及呼吸道，可以引起人不同程度腹瀉、出血性結(jié)腸炎等，嚴重的可導致死亡[2,3]。EHEC是典型的條件致病菌，常于動物抵抗力下降時引起暴發(fā)性流行，如鵝腹瀉、家兔的腸炎、雛雞腹瀉、綿羊的傳染性口炎、大熊貓的腹瀉、豬腹瀉等[4-6]。

噬菌體是一種殺滅細菌的病毒，已被科學家作為對付多重耐藥菌新的希望，因此也成為了當前的研究熱點。同時，由于當前伴隨細菌耐藥性越來越強且新型抗生素研發(fā)困難使得噬菌體作為抗生素的替代品重新受到關(guān)注。本研究分離獲得1株寬噬菌譜裂解性腸出血性大腸桿菌噬菌體，并分析了其生物學特性及體外殺菌特性，為研制腸出血性大腸桿菌噬菌體防控產(chǎn)品提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑實驗用菌種ATCC 35150、CCTCC AB 200051、ATCC 12795、ATCC BAA-2469、ATCC 23982、ATCC 29552、ATCC BAA-2190、ATCC BAA-2216由本實驗室保存；污水樣采集自南京及周邊養(yǎng)殖場。LB培養(yǎng)基、瓊脂購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；聚乙二醇8000（polyethylene glycol， PEG8000）、氯仿、鹽酸和NaCl購自南京知凡生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設備HZL-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市強樂實驗設備有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；HFU486Basic超低溫冰箱，德國Thermo公司；DELTA320 pH計；瑞士Mettler Toledo公司SW-CJ-1F超凈臺，蘇州真田潔凈設備有限公司。

1.3 噬菌體的富集參照本研究室前期采用的方法[7]：以腸出血性大腸桿菌ATCC 35150為宿主菌分離噬菌體，首先在南京及周邊養(yǎng)殖場采集污水樣品，水樣經(jīng)過濾除菌。將濾液和宿主菌ATCC 35150在LB培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，進行噬菌體擴增富集。

1.4 噬菌斑的純化及噬菌體顆粒制備參考文獻[8]報道方法進行單層平板點樣實驗，挑選具有明顯溶菌空斑的樣品，進行雙層平板實驗[9]。噬菌體顆粒沉淀采用PEG/NaCl提取方法進行制備[10]，噬菌體純化后保存于4℃，備用。

1.5 噬菌體宿主譜分析實驗參考文獻[11]報道方法分析噬菌體噬菌譜。分別檢測噬菌體對以下菌種的裂解活性：ATCC 35150、CCTCC AB 200051、ATCC 12795、ATCC BAA-2469、ATCC 23982、ATCC 29552、ATCC BAA-2190、ATCC BAA-2216，并統(tǒng)計各細菌的裂解情況。

1.6 噬菌體透射電鏡觀察參考文獻[9]報道方法進行透射電鏡觀察樣品制備，完成樣品制備后，采用日立H7650型透射電子顯微鏡觀察。

1.7 噬菌體酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的測定參照本研究室前期采用的的方法[7]。pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12；溫度檢測設置為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，測定噬菌體效價變化，重復3次，每次設2個平行。

1.8 噬菌體一步生長曲線實驗分析參考Leuschner等[12]方法，實驗重復3次，每次設2個平行，繪制一步生長曲線。

1.9 噬菌體vB_EcoM_C1控制養(yǎng)殖環(huán)境中的腸出血性大腸桿菌的污染以奶牛場作為試驗地點，選擇腸出血性大腸桿菌ATCC 35150臨床株為試驗菌株，將濃度為105CFU/mL的腸出血性大腸桿菌取1 mL均勻噴灑在料槽表面（1m2），然后以濃度為108PFU/mL噬菌體vB_EcoM_C1 1 mL對料槽表面實施噴殺，1 h后，使用平板計數(shù)法檢測料槽表面腸出血性大腸桿菌的數(shù)量。在料槽隨機取3個樣品。將5 cm×5 cm的滅菌規(guī)格板（BZS50515，南京便診生物科技有限公司）放于料槽表面，在取樣范圍內(nèi)將沾有無菌生理鹽水的滅菌棉棒反復擦拭10次，取樣后迅速將棉棒放入裝有10 mL無菌生理鹽水的無菌密閉三角瓶中，立即送至實驗室，在室溫置于搖床孵育30 min（80 r/min），然后做10倍梯度稀釋，在LB平板上培養(yǎng)計數(shù)，檢測采集到的腸出血性大腸桿菌數(shù)目，最終計數(shù)結(jié)果取3處平均值（CFU/m2）。

圖1 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1噬菌斑Fig.1 Plaques of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_ EcoM_C1

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離純化及其噬菌斑形態(tài)、透射電鏡觀察37℃培養(yǎng)12 h，本研究分離的V_ EcoM_C1在LB培養(yǎng)平板上噬菌斑直徑為1.0～1.5 mm。由圖1可知，在雙層平板上腸出血性大腸桿菌噬菌體V_EcoM_C1均呈現(xiàn)出典型裂解性噬菌體特征，空斑透亮，無暈環(huán)，空斑邊緣整齊清晰。由圖2可知，噬菌體V_ EcoM_C1頭部橢圓形，長徑約86 nm，橫徑約54 nm，具有可收縮性尾，尾長約76 nm，直徑約10 nm。按國際病毒分類委員會分類規(guī)則[15]，噬菌體V_ EcoM_C1頭部與尾部被頸圈隔開，具有可收縮肌鞘，V_ EcoM_C1屬于尾噬菌體目，肌尾病毒科。

2.2 噬菌體VB_ EcoM_C1的宿主譜分析將噬菌體VB_ EcoM_C1與不同種屬標準菌株作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該噬菌體在4株非O157腸出血性大腸桿菌和2株O157腸出血性大腸桿菌平板上均能形成噬菌斑，說明噬菌體V_ EcoM_C1可裂解5種不同血清型腸出血性大腸桿菌，且噬菌斑透亮，表明噬菌體V_EcoM_C1對ATCC 35150等5株菌具有較強的裂解作用（表1）。

圖2 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1的透射電鏡觀察Fig.2 Transmission electron micrographs of phage of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1

表1 噬菌體V_ EcoM_C1噬菌譜Table 1 The host range of phage V_EcoM_C1

2.3 噬菌體V_ EcoM_C1的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性由圖3可知，噬菌體V_ EcoM_C1在pH 5～10效價較穩(wěn)定，但pH值＜5以及＞10都會引起效價的明顯減少，而當 pH≤3或≥12時，檢測不到噬菌斑。由圖4可知，噬菌體V_ EcoM_C1在各溫度下作用30、60 min后效價變化不大，說明在30℃～50℃噬菌體V_ EcoM_C1幾乎維持在初始效價，但60℃時下降較快，且60 min組降低幅度大于30 min組， 80℃之后已基本無噬菌體存在，表明高溫會嚴重破壞噬菌體的活性。

圖3 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1對酸堿的耐受能力Fig.3 Resistance of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 to acid and alkali

圖4 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1對溫度的耐受能力Fig.4 Resistance of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 to temperature

2.4 噬菌體vB_EcoM_C1的一步生長曲線由圖5可知，噬菌體V_ EcoM_C1感染宿主菌的潛伏期約10 min，爆發(fā)持續(xù)時間約60 min，平均爆發(fā)量為26，具有較高的裂解活性。

2.5 噬菌體vB_EcoM_C1控制養(yǎng)殖環(huán)境中的腸出血性大腸桿菌的污染使用平板計數(shù)法檢測料槽表面腸出血性大腸桿菌的數(shù)量。檢測結(jié)果如圖6顯示，1 h后，料槽表面腸出血性大腸桿菌的數(shù)量降到103CFU/m2以下，5 h后，料槽表面腸出血性大腸桿菌的數(shù)量降到10 CFU/m2以下，說明該噬菌體可以有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境（奶牛料槽表面）中的腸出血性大腸桿菌。

圖5 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1在37 ℃的LB培養(yǎng)液中的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curves of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 in LB at 37 ℃

圖6 腸出血性大腸桿菌噬菌體V_ EcoM_C1在養(yǎng)殖環(huán)境中裂解活性分析Fig.6 Lytic activity of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1

3 討論

噬菌體作為一種能夠高效裂解細菌的病毒，將有可能替代抗生素防制細菌性感染疾病。本研究從養(yǎng)殖場采集的污水樣品中分離到寬噬菌譜腸出血性大腸桿菌烈性噬菌體V_ EcoM_C1，并進行了噬菌斑、噬菌譜、形態(tài)學（透射電鏡）、遺傳物質(zhì)、酸堿及熱穩(wěn)定性、一步生長曲線等生物學特性及控制養(yǎng)殖環(huán)境中的腸出血性大腸桿菌的污染研究。結(jié)果表明：噬菌體V_EcoM_C1均呈現(xiàn)出典型裂解性噬菌體特征，空斑透亮，無暈環(huán)；噬菌體V_EcoM_C1噬菌斑直徑為1.0～1.5 mm；噬菌體V_ EcoM_C1頭部橢圓形，長徑約86 nm，橫徑約54 nm；噬菌體V_EcoM_C1具有可收縮性尾，尾長約76 nm，直徑約10 nm，頭部與尾部被頸圈隔開；噬菌體V_ EcoM_C1可裂解5種不同血清型腸出血性大腸桿菌，且噬菌斑都極其透亮，噬菌譜寬；在30℃～50℃保持高活性；在pH5～10穩(wěn)定；噬菌體V_ EcoM_C1感染宿主菌的潛伏期約10 min，爆發(fā)持續(xù)時間約60 min，平均爆發(fā)量為26，具有較高的裂解活性；控制養(yǎng)殖環(huán)境中的腸出血性大腸桿菌證明該噬菌體可以有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境（奶牛料槽表面）中的腸出血性大腸桿菌。是一株寬噬菌譜腸出血性大腸桿菌烈性噬菌體。

青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類等β-內(nèi)酰胺類藥物是防治腸出血性大腸桿菌感染最主要的藥物，其中青霉素類和頭孢類藥物在治療腸出血性大腸桿菌感染中廣泛使用，但由于長期的藥物選擇性壓力，病原菌表現(xiàn)出了對這些藥物嚴重的耐藥性。噬菌體是一種殺滅細菌的病毒，噬菌體對宿主細菌的特異性高、強大的裂解能力以及對人類和動物（產(chǎn)品）沒有毒副作用、不會產(chǎn)生藥物殘留等優(yōu)勢而顯示出了比抗生素更加廣闊的應用前景和價值[13-18]。

噬菌體制劑的研制開發(fā)和應用無疑是解決這一問題的理想方法，在噬菌體產(chǎn)品開發(fā)方面，東歐一些國家已經(jīng)批準某些噬菌體產(chǎn)品應用于人類皮膚金葡菌感染的治療[19]，美國也批準某些產(chǎn)品應用于動物性食品的表面消毒，如2006年美國FDA批準李斯特噬菌體制劑在禽產(chǎn)品和芝士上應用，用于消毒[20]。噬菌體的裂解活性具有種屬特異性和高裂解活性，通?？筛咝饧毦毎?，為腸出血性大腸桿菌防控提供了新的思路。本試驗已對分離純化的腸出血性大腸桿菌噬菌體進行了生物學特性研究，后續(xù)還將進行應用效果及應用安全性研究，以期為臨床上研發(fā)噬菌體治療腸出血性大腸桿菌制劑提供理論依據(jù)。