流產(chǎn)奶牛胎兒肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定

葉勇剛，廖黨金，張明國，康潤民，肖 璐，謝 晶，曹 冶，張 濤

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室 成都 610066；3.涼山科華奶牛繁育有限公司，西昌615099；4.涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，西昌 615042）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae）屬腸桿菌科腸道桿菌屬克雷伯氏菌種，是一種人獸共患、革蘭氏陰性條件致病菌。該菌在自然界廣泛分布，可存在于人、畜禽的呼吸道和消化道，一般情況下不致病，但當(dāng)動物機體免疫力下降時，可引發(fā)支氣管炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染、敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等[1-4]。近年來肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的家畜疾病屢見報到，但感染奶牛的報道相對較少，尤其未見引起奶牛流產(chǎn)[5-8]。

2017年4月，四川攀西地區(qū)一奶牛（荷斯坦）養(yǎng)殖小區(qū)發(fā)生1例懷孕7個月奶牛流產(chǎn)，母牛出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎及疑似癱瘓癥狀，采用補鈣和一般抗生素治療后，效果不良。本研究從無菌采集的胎兒腹水和心血中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌，通過微生物分離純化、生化鑒定、16S rRNA 擴增測序、小鼠致病性試驗鑒定該菌株為致病性肺炎克雷伯氏菌，并根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果，給予母牛治療，最終母牛得以治愈。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、抗生素藥敏紙片和微量生化反應(yīng)管均購自杭州微生物試劑有限公司；Mueller-hinton agar和Mueller-hinton BROTH購自上海葉舟生物科技有限公司；2×TaqPCR Mastermix和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；D2000 Plus DNA ladder購自中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.2 病料和試驗動物 流產(chǎn)胎兒組織樣本來自四川攀西地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖小區(qū)；40 d昆明鼠購置四川成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.3 引物 16S rRNA通用引物 27F: 5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；1492R: 5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3'；16S～23S rRNA 通用引物（Jensen等[9]設(shè)計）F: 5'-GAAGTCGTAGTAA CAAGG-3'；R: 5'-CAAGGCATCCACCGT-3'。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離純化 用接種環(huán)無菌采集流產(chǎn)胎兒心血和腹水接種于肉湯培養(yǎng)基中，帶回實驗室37℃培養(yǎng)，過夜后于超凈臺無菌涂于血瓊脂培平板上分離單菌落，并對分離株純培養(yǎng)細菌進行革蘭氏染色，觀察細菌個體形態(tài)，然后接種于麥康凱培養(yǎng)基觀察其培養(yǎng)特征。

1.2.2 生化試驗 將分離純化的細菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂中，培養(yǎng) 24 h并按照微量生化管說明書進行生化試驗。

1.2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA 核苷酸序列鑒定挑取單菌落溶于10 μL ddH2O混成菌液作為DNA模板。反應(yīng)體系（20 μL）：DNA模板(菌液)1 μL，PCR Mstermix 10 μL，dd H2O 7 μL，上下游引物各1 μL（50 ng/μL）。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2 min，94℃變性30 S， 55℃退火30 S，72℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后回收，純化后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果在 NCBI上進行BLAST 比對鑒定。

1.2.4 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散方法，對常見的28種抗生素進行藥敏試驗，結(jié)果參照 national committee clinicallaboratory standards（NCCLS）藥敏試驗標準按敏感、中度敏感和耐藥進行判定。

1.2.5 致病性試驗 挑取分離純化的單菌落于Muellerhinton BROTH培養(yǎng)基中35℃搖菌培養(yǎng)過夜，部分用比濁管按1.2×109cfu/mL稀釋。將小白鼠分為4個組，每組5只，第1組于腹腔接種培養(yǎng)過夜原菌液0.2 mL；第2組于腹腔接種濃度為1.2×109cfu/mL菌液0.2 mL；第3組為對照組，于腹腔接種MH培養(yǎng)基0.2 mL；第4組為對照組，不接種任何物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)在麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂平板培養(yǎng)基上均長出1～2 mm的黏液狀菌落，經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢見革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，見圖1。

2.2 生化特性該菌能分解葡萄糖和乳糖，分解葡萄糖能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽，分解尿素，V-P試驗呈陽性。該分離菌的生化特征基本與報道的肺炎克雷伯氏菌一致[10]，具體見表1。

2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA基因鑒定16S rRNA基因擴增結(jié)果顯示，PCR擴增片段位于1000～2000 bp（見圖2A）。BLAST結(jié)果顯示，分離菌株的16S rRNA基因序列與肺炎克雷伯氏菌 16S rRNA基因序列的同源性為 99%，16S～23S rRNA基因擴增結(jié)果顯示，該PCR擴增出3個片段（見圖2B），測序結(jié)果表明該分離株的16S～23S rRNA序列與肺炎克雷伯氏菌的16S～23S rRNA同源性最高。以上結(jié)果表明，該分離細菌為肺炎克雷伯氏菌。

圖1 肺炎克雷伯氏菌革蘭氏染色Fig.1 Gran staining of Klebsiella pneumoniae

表1 細菌生化鑒定結(jié)果Table 1 The results of biochemical test of the bacteria

圖2 16S rRNA (A)和 16S～23S rRNA(B)基因的PCR擴增Fig.2 The PCR ampli fication of 16S rRNA (A) and 16S～23S rRNA gene(B)

2.4 藥敏試驗在選用的常見28種抗生素中，該分離菌株對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林、多粘菌素等16種抗生素敏感；對多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素等7種抗生素中度敏感；對青霉素、苯唑西林、紅霉素、米諾環(huán)素和氯唑西林耐藥，具體見表2。

2.5 動物試驗接種0.2 mL原菌液組的小鼠于24 h內(nèi)全部死亡，接種0.2 mL 1.2×109cfu/mL菌液組小鼠于36 h內(nèi)全部死亡；而對照未見任何臨床癥狀。解剖小鼠，可見其肺臟、胸腔有明顯出血，腹腔有大量積液；取腹腔積液或胸腔積液進行染色鏡檢，均可見大量革蘭氏陰性短桿菌，與犢牛分離病原菌形態(tài)一致。

3 討論

PCR和DNA堿基測序技術(shù)用于鑒定細菌種類具有快速、準確的優(yōu)勢，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于對未知菌種進行檢測。其中16S rRNA和16S～23S rRNA 編碼的基因序列具有高度保守和變異的特性，是用于鑒定細菌的理想靶序列[11,12]。16S rRNA適合于細菌屬內(nèi)種間的鑒定，在分類學(xué)中被譽為“金標準”，但由于進化慢，序列相對保守，對相近種或同一種不同型之間進行鑒別存在一定缺陷，如大腸埃希菌與宋內(nèi)志賀菌、炭疽桿菌與蠟樣芽胞桿菌的16S rRNA序列相同，因此無法用此基因片段進行鑒別[13]。而16S～23S rRNA間隔區(qū)序列（intergenic spacer region，ISR）除保守外，其進化速度高于16S rRNA的10倍，能對相近菌種和同種內(nèi)的不同菌株進行鑒別，成為細菌分類和鑒定的熱點[14]。本試驗采用16S rRNA通用引物，成功擴增了16S rRNA基因片段，通過測序確定了該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。此外，本研究還借鑒了Jesen等[9]設(shè)計的經(jīng)典引物對本株肺炎克雷伯氏菌進行擴增，擴增結(jié)果顯示在250～500 bp間出現(xiàn)3條帶的特異性圖譜，測序結(jié)果同樣證明了該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。

據(jù)報道，肺炎克雷伯氏菌可產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶，如產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和碳青霉烯酶；此外，肺炎克雷伯氏菌還可通過缺失菌體外模蛋白、改變抗生素作用靶位，以及產(chǎn)生生物膜等機制產(chǎn)生耐藥[15]。畜禽生產(chǎn)過程中，抗生素作為促生長的飼料添加藥物和臨床不合理使用抗生素，使畜禽肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)生了嚴重的耐藥性。

表2 藥敏試驗結(jié)果Table 2 The result of drug sensitive test

肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的疾病越來越常見，現(xiàn)均能從人、牛、羊、豬、皮毛動物等中分離到致病性肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯氏菌感染奶牛主要造成奶牛乳房炎、肺炎、子宮內(nèi)膜炎，也有報道在流產(chǎn)奶牛胎兒中分離到肺炎克雷伯氏菌，但其不是造成奶牛流產(chǎn)的主要病因[16,17]。本試驗從流產(chǎn)奶牛胎兒心血和腹腔液中分離到1株細菌，采用16S rRNA基因擴增測序、生化鑒定等方法確定該分離菌株為肺炎克雷伯氏菌，小白鼠感染試驗證明其具有很強的致病力；加之沒有分離到其他的病原菌，由此判斷，可能是孕牛免疫力低下，肺炎克雷伯氏菌乘機在孕牛體內(nèi)大量繁殖而引起奶牛發(fā)病和流產(chǎn)，病原菌經(jīng)垂直傳播給胎兒。另外試驗還通過藥敏試驗，篩選出敏感性藥物并對臨床生產(chǎn)進行指導(dǎo)用藥，取得了較好的治療效果，進一步證明了該奶牛的流產(chǎn)與肺炎克雷伯氏菌相關(guān)。肺炎克雷伯氏菌作為一種人獸共患病原菌，奶牛場應(yīng)加大對該類疫病的預(yù)防，除科學(xué)使用抗生素外，還需加強衛(wèi)生消毒，加強飼養(yǎng)管理，用藥前多做相關(guān)藥敏試驗，實施針對性用藥，提高防治效果。