豬源β-防御素2 和3 的研究進(jìn)展

劉璨穎，陳志勝，林裕鋒，計(jì)慧琴，王丙云，陳勝鋒

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000）

防御素是一類(lèi)自然產(chǎn)生的防御分子，具有廣泛的抗細(xì)菌、病毒、真菌活性，且病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性。防御素的免疫調(diào)控功能日益受到重視，其在炎癥、創(chuàng)傷疾病治療和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)方面也有一定作用[1-6]。防御素依據(jù)其二硫鍵的位置分為3 個(gè)亞類(lèi)（α-、β-和θ-防御素）[7]。目前，未見(jiàn)α-和θ-防御素在豬中被報(bào)道，而在豬中被鑒定的β-防御素有29 種[8-10]。大多數(shù)β-防御素基因有典型的2 個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，其中第1 個(gè)外顯子編碼疏水性富含亮氨酸信號(hào)序列的前肽，第2 個(gè)外顯子編碼有活性的成熟多肽。成熟多肽含有6 個(gè)穩(wěn)定的半胱氨酸，分別以1-6、2-4、3-5 連接形成3 個(gè)分子的二硫鍵，構(gòu)成穩(wěn)定的反相平行的3 股β- 片層結(jié)構(gòu)[6]。大多數(shù)豬源β-防御素（Porcine β-defensin，pBD）和人源β-防御素（Human β-defensin，hBD）在序列長(zhǎng)度和保守性上有很大相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，人源和豬源的防御素基因來(lái)源于同一個(gè)祖先，不同物種中對(duì)應(yīng)防御素的同源性高于同物種不同防御素的同源性[10]。

在目前的養(yǎng)豬業(yè)中，由抗生素濫用導(dǎo)致的病原微生物耐藥性給畜牧養(yǎng)殖和臨床治療造成了嚴(yán)重威脅[11]，急需可以代替抗生素的新型抗病原微生物藥物。β- 防御素作為動(dòng)物機(jī)體天然分泌的小分子活性多肽，具有較好的抗病原微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能。β- 防御素有獨(dú)特的抗菌作用機(jī)理，使得病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[9]。因此，pBD 在畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中具有替代抗生素的潛能。豬源β- 防御素2（Porcine β-defensin 2，pBD2）和豬源β- 防御素3（Porcine β-defensin 3，pBD3）分別是含有69 和67 個(gè)氨基酸的多肽。成熟多肽pBD2 在氨基酸序列上與人源β- 防御素1（Human β-defensin 1，hBD1）有60%的同源性。之前已有關(guān)于豬源防御素研究進(jìn)展的綜述，主要集中于pBD 的分子結(jié)構(gòu)、體內(nèi)分布、抗菌機(jī)制和表達(dá)方法的研究[9,12-14]。本文綜述了近些年pBD2 和pBD3 表達(dá)調(diào)控的相關(guān)因素、參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路、在生殖發(fā)育中的新功能和在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用，闡述其發(fā)揮生物活性的機(jī)制和潛在的應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)今后pBD2 和pBD3 的研究方向進(jìn)行展望。

1 pBD 的表達(dá)和調(diào)控

1.1 pBD 在體內(nèi)的表達(dá)特性 豬源β- 防御素在體內(nèi)的表達(dá)具有種類(lèi)差異性，也有組織特異性和品種差異性。例如，pBD2 和pBD3 均在骨髓及其他淋巴組織中表達(dá)，包括胸腺、脾、淋巴結(jié)、卵巢、十二指腸和肝臟；除此之外，pBD2 也在舌、腎臟和大腸中表達(dá)，而pBD123、pBD125 和pBD129 主要在雄性生殖組織中表達(dá)[8,15]。pBD3 表達(dá)量最高的組織是舌和口腔黏膜，而pBD2 表達(dá)量最高的組織是腎臟和肝臟。pBD3 基因在藏豬大部分組織中的mRNA 表達(dá)量高于杜×長(zhǎng)×大雜交豬，而pBD2 基因在杜×長(zhǎng)×大雜交豬大部分組織中的mRNA 表達(dá)量高于藏豬[16]。在抗病力較強(qiáng)的地方豬種梅山豬的小腸黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等與外界接觸的多個(gè)組織中，pBD2 和pBD3 的表達(dá)水平均高于杜×長(zhǎng)×大雜交豬[17-18]。

1.2 pBD 的表達(dá)調(diào)控 pBD 的表達(dá)還受發(fā)育階段調(diào)控，且不同種類(lèi)防御素的表達(dá)調(diào)控模式不同。雖然pBD2 和pBD3 都在豬卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)，但pBD2 的mRNA表達(dá)水平與卵泡發(fā)育階段有關(guān)，其在小卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)量最高，隨著卵泡發(fā)育，其在大卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平逐漸降低；而pBD3 在大卵泡和小卵泡顆粒細(xì)胞中的mRNA 表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異[18]。在仔豬空腸中，pBD2 基因的mRNA 表達(dá)水平在斷奶后（出生35 d）較出生21 d 顯著升高，可能是因?yàn)閿嗄唐茐牧四c道完整性，微生物入侵刺激了腸上皮分泌防御素[20]。pBD115 在2周齡豬的睪丸中表達(dá)水平較高，而在5 月齡豬的睪丸中不表達(dá)[8]。

pBD2 與pBD3 在體內(nèi)外的表達(dá)水平受外源病原微生物、營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激、炎性誘導(dǎo)介質(zhì)、膳食化合物中短鏈脂肪酸及其類(lèi)似物、維生素、Zn2+和L-異亮氨酸等調(diào)節(jié)[18-19,21-23]。在1×108CFU/mL 羅伊氏乳桿菌I5007 作用6 h 下，豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2 中pBD2 和pBD3 表達(dá)量增高，口服1×1010CFU 羅伊氏乳桿菌I5007 能提高新生仔豬空腸中pBD2 和結(jié)腸中pBD2 與pBD3 的表達(dá)量[24]。膳食化合物中短鏈脂肪酸（如組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉）能提高豬腎臟細(xì)胞PK-15 中pBD3 的mRNA 表達(dá)水平，但另一種組蛋白去乙?；敢种苿┣帕夭荒苷{(diào)節(jié)pBD3 的表達(dá)水平，這可能與組蛋白去乙?；敢种苿┯胁煌淖饔冒悬c(diǎn)有關(guān)[25]。在IPEC-J2 中也證實(shí)含有3～8個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸對(duì)pBD2 和pBD3 基因的mRNA表達(dá)有較為顯著的誘導(dǎo)作用，其中8～16 mmol/L 丁酸鹽的誘導(dǎo)效果較好，丁酸鹽的類(lèi)似物甘油三丁酸酯、丁酸芐酯和4-苯基丁酸鈉鹽也有相似的誘導(dǎo)作用[21]。此外，在IPEC-J2 細(xì) 胞系 中，25 μmol/mL 或100 μmol/mL 硫酸鋅和50 μg/mL 異亮氨酸也能提高pBD2 和pBD3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平[22]。營(yíng)養(yǎng)元素中維生素A、D、E 均能夠不同程度地誘導(dǎo)IPEC-J2 細(xì)胞pBD2 或pBD3基因的表達(dá)并促進(jìn)其蛋白的分泌，其中，0.5～20 μmol/L 維生素A 的誘導(dǎo)效果最好。以杜×長(zhǎng)×大雜交豬和榮昌豬為動(dòng)物模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂含2～200 IU/kg維生素A 日糧的實(shí)驗(yàn)組中，舌、口腔黏膜、小腸黏膜和肺等組織中內(nèi)源性pBD2 和pBD3 的表達(dá)水平均有顯著提高[17]。異亮氨酸、精氨酸和Zn2+處理IPEC-J2 細(xì)胞會(huì)使其pBD2 和pBD3 基因表達(dá)上調(diào)，而饑餓營(yíng)養(yǎng)基處理會(huì)下調(diào)pBD 表達(dá)[16,22]。

1.3 pBD2 和pBD3 參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路 pBD2 和pBD3 參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路包括有絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（Sirtuin1，Sirt1）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead box O，F(xiàn)oxO）、核 因 子-κB（Nuclear Factor κB，NF-κB）和Toll-樣受體2（Toll-like Receptor-2，TLR2）信號(hào)通路等。TLR2 的激活能直接調(diào)節(jié)pBD3 的表達(dá)，外源肽聚糖能激活TLR2，TLR2 沉默的PK-15 細(xì)胞在受到肽聚糖刺激后pBD3 表達(dá)減少[25]。組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對(duì)pBD3 的誘導(dǎo)表達(dá)與NF-κB 信號(hào)通路的激活有關(guān)[25]。營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激和氨基酸對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞中pBD2 和pBD3 表達(dá)的調(diào)控與Sirt1、FoxO 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）信號(hào)通路可能有關(guān)，應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)FoxO 依賴通路調(diào)節(jié)Sirt1，而Sirt1 可直接影響防御素的表達(dá)[23,26-27]；異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸對(duì)pBD 的誘導(dǎo)表達(dá)可能與ERK1/2 的磷酸化有關(guān)[28]。pBD3 對(duì)豬源大卵泡顆粒細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用可能與激活MAPK- ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)[29]。

2 豬源pBD2 和pBD3 的功能機(jī)制研究

2.1 pBD2 和pBD3 在抗菌方面的作用 防御素通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗病原微生物活性，其中包括阻止細(xì)胞壁生物合成、抑制生物膜形成、對(duì)外周的細(xì)胞壁穿孔，通過(guò)自身的正電荷殘基與細(xì)菌細(xì)胞膜表面脂多糖或磷脂分子的陰離子電荷互作從而中和外毒素，或者增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，進(jìn)入細(xì)菌直接靶向DNA 或RNA 而殺死細(xì)菌[30-32]。在豬源防御素中，pBD2 是研究較多的防御素；pBD2 對(duì)包括多耐藥性菌株在內(nèi)的革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌都有較好的抑菌效果；4～8 μmol/L pBD2 能在3 h 內(nèi)殺死鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌、李斯特氏菌和紅斑丹毒絲菌[33]，且超表達(dá)pBD2 的轉(zhuǎn)基因豬對(duì)常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)病原菌胸膜肺炎放線桿菌的抵抗力增強(qiáng)[34]。此外，豬防御素和抗生素還有協(xié)同抑菌效果[35]。為了研究防御素正電荷殘基與其抗菌能力的關(guān)系，有研究者對(duì)成熟pBD2 多肽（含有37 個(gè)氨基酸）中的8 個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別進(jìn)行單位點(diǎn)突變；在不影響pBD2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下，用中性或堿性氨基酸代替酸性氨基酸來(lái)增加多肽的凈正電荷，檢測(cè)pBD2 突變體的抗菌活性[36]。該研究結(jié)果顯示，具有最高正電荷的pBD2 突變體并沒(méi)有顯示出最強(qiáng)的抗菌活性，pBD2 突變體中僅有I4R 的抗菌活性較高；證實(shí)pBD2 的抗菌活性不僅與其正電荷殘基有關(guān)，可能還與其正電荷殘基在分子表面的排列、與其正電荷殘基對(duì)分子和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用等有關(guān)[36]。pBD2 突變體I4R不僅有更強(qiáng)的抗菌活性，而且其抗菌活性更持久，對(duì)豬紅細(xì)胞的毒性低、溶血作用小，因此I4R 可能具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[36]。

2.2 pBD2 和pBD3 在促進(jìn)生長(zhǎng)和抑制炎癥方面的作用有研究證實(shí)pBD2 能促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，具有替代抗生素的潛力[37-39]。每千克基礎(chǔ)日糧中添加5 g pBD2 可提高斷奶仔豬的體重、平均日增重量和平均日采食量，降低仔豬斷奶后腹瀉發(fā)生率，能和益生菌一樣影響腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)，提高盲腸食糜中益生菌的拷貝數(shù)，減少病原菌[37-38]。飼喂防御素能夠明顯改善母豬體況，提高仔豬成活率和健康水平，從而提高養(yǎng)豬效益。妊娠母豬日糧中添加2 g/kg 基因工程防御素可提高仔豬出生成活率，降低弱仔率、死胎率、發(fā)病率和死亡率[39]。保育豬飼喂防御素后發(fā)病率和死亡率也得到降低[39]。此外，pBD2 能降低硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥與黏膜病變；pBD2 可能通過(guò)上調(diào)與緊密連接和黏蛋白相關(guān)蛋白基因（包括閉鎖小帶蛋白1、2，緊密連接蛋白1，黏液素1 和2）的表達(dá)，抑制硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)的炎癥，通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶和細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮作用。pBD2 直腸內(nèi)給藥可能作為潰瘍性結(jié)腸炎的一種新型預(yù)防措施[40]。

2.3 pBD2 和pBD3 在生殖方面的作用 近期有研究顯示，部分pBD 與雄性動(dòng)物精子的運(yùn)動(dòng)能力以及雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育有關(guān)[29,41]。5 μmol/L pBD1 和pBD2 能降低精子的運(yùn)動(dòng)能力，3 μmol/L pBD1 和pBD2 雖對(duì)精子活力無(wú)影響，但有較好的抑菌作用，因此3 μmol/L 的pBD1 和pBD2 可以用作豬精液貯液中的抗生素替代物[41]。pBD3能顯著提高小卵泡顆粒細(xì)胞的增殖與遷移能力，且其增殖促進(jìn)作用可能與pBD3 顯著提高小卵泡顆粒細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）編碼基因的mRNA 水平有關(guān)，而pBD2 對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖無(wú)顯著作用，50 μg/mL pBD2 還會(huì)抑制大卵泡顆粒細(xì)胞的遷移作用[29]。

2.4 hBD3 在臨床應(yīng)用中的研究 pBD 與hBD 在氨基酸序列上有一定的同源性。在臨床應(yīng)用研究中證實(shí)，hBD3 可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞中的免疫反應(yīng)而控制牙周炎的發(fā)展[42]，可以減輕由鼠傷寒沙門(mén)氏菌調(diào)節(jié)因子表達(dá)和增強(qiáng)糞腸球菌活性而引起的腸損傷[43]。hBD3 作為佐劑，還能顯著提高金黃色葡萄球菌滅活疫苗的免疫效果[44]。hBD3 可以在轉(zhuǎn)基因牛腺體中表達(dá)，并對(duì)致乳腺炎的病原菌有抑制作用[45]。對(duì)hBD3 功能片段的研究中發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列C 末端15 個(gè)氨基酸構(gòu)成的小肽仍具有與hBD3 相當(dāng)?shù)挠行Э咕钚?、皮膚和細(xì)胞滲透活性，且該片段能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮、一氧化氮合酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，能作為治療免疫疾病時(shí)的藥物載體[46]。hBD3 的γ 核心片段（EEQIGKSSTRGRKCCRRKK）具有hBD3 最重要的生物學(xué)特性，對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒和單純皰疹病毒有抗病毒活性[46]。此外，hBD3 的衍生物CHRG01 僅含有14 個(gè)氨基酸（KSSTRGRKSSRRKK）的多肽，也能滲透細(xì)菌的外膜而具有殺菌作用[48]。

3 小結(jié)與展望

pBD 除了具有較好的抗病原微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能外，對(duì)動(dòng)物腸道內(nèi)固有益生菌和細(xì)胞危害小，對(duì)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)和生殖發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用。因此，pBD 在畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中具有替代抗生素的潛能，在畜牧養(yǎng)殖中可作為飼料添加劑使用。且在體外表達(dá)pBD 方面，有研究證實(shí)pBD2 在工程菌畢赤酵母中能大量高效表達(dá)，且能耐受高溫、極端pH 和部分有機(jī)溶劑[49]，這為體外大量表達(dá)pBD 應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中提供了理論基礎(chǔ)。但目前關(guān)于pBD 的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于hBD，因此今后還需要不斷挖掘pBD2 和pBD3 在畜牧養(yǎng)殖和疾病治療中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)其功能片段進(jìn)行探究，該活性多肽將有望應(yīng)用于臨床，為多種疾病的治療提供新手段。