中山杉組織培養(yǎng)中無菌體系建立的初步研究

黃志偉，曹 劍

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中山杉組織培養(yǎng)中無菌體系建立的初步研究

黃志偉，曹 劍

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院 農(nóng)林科技系，重慶 404155）

為建立中山杉Zhongshanshan’無菌體系，從中山杉外植體消毒及腋芽啟動兩方面開展研究。外植體消毒試驗(yàn)以枝條類型、HgCl2濃度及其處理時間為試驗(yàn)因素，采用3因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果表明：采用木質(zhì)化嫩梢作為外植體的消毒處理污染率都高達(dá)100%，而采用未木質(zhì)化嫩梢作為外植體，0.2% HgCl2處理10 min進(jìn)行消毒效果最好，污染率為0；外植體腋芽啟動試驗(yàn)則以NAA，6-BA和活性炭為試驗(yàn)因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34），試驗(yàn)結(jié)果表明：NAA，6-BA對中山杉腋芽萌動都有促進(jìn)作用，其中6-BA起主導(dǎo)作用，而活性炭則對中山杉腋芽萌動有抑制作用，其腋芽啟動效果最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1，腋芽啟動率達(dá)84.62%。

中山杉；無菌體系；外植體消毒；腋芽啟動

中山杉Zhongshanshan’為杉科Taxodiaceae落羽杉屬半常綠高大喬木，具有耐水淹、耐鹽堿、抗風(fēng)力強(qiáng)、病蟲害少、樹形美觀等特點(diǎn)。目前中山杉作為長江三峽庫區(qū)消落帶植被恢復(fù)的絕佳樹種[1-2]，用苗量激增，采用傳統(tǒng)的扦插繁殖，其繁殖系數(shù)較低且受季節(jié)影響較大[3]，苗木市場上出現(xiàn)一苗難求現(xiàn)象，制約了三峽庫區(qū)消落帶生態(tài)植被恢復(fù)的發(fā)展，故必須尋求更好地中山杉種苗繁育途徑。

目前，中山杉組織培養(yǎng)育苗的報(bào)道極少，僅唐興國、朱躍珍、郝樹芹等做了中山杉組培快繁技術(shù)的初步研究[4-6]，存在污染率偏高，存活率較低及芽誘導(dǎo)率不高等諸多問題，其組培育苗技術(shù)在生產(chǎn)上難以應(yīng)用。本試驗(yàn)采用中山杉當(dāng)年生健壯嫩枝作為外植體，就中山杉組織培養(yǎng)中無菌體系建立，包括外植體消毒及腋芽啟動培養(yǎng)開展研究，以期建立起較穩(wěn)定的中山杉組織培養(yǎng)體系，為探索適合中山杉工廠化育苗的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)材料及技術(shù)支撐，同時為該樹種的推廣種植提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自重慶市禾佳香料植物開發(fā)有限公司中山杉118品種采穗圃，以8年生優(yōu)良單株當(dāng)年生健壯枝條作為試驗(yàn)材料。

試劑HgCl2（廣州化學(xué)試劑廠），α-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、瓊脂粉、活性炭試劑來自上海伊卡生物公司，酒精（無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司），蔗糖（天津市福晨化學(xué)試劑廠），洗衣粉采用的是雕牌速溶快潔無磷洗衣粉，超凈工作臺（上海貝塔，型號CA-S-11）。

1.2 外植體采集及預(yù)處理

1.2.1 中山杉外植體消毒 于2017年11月16日，采集健壯、莖粗約0.5 cm、無病蟲害的當(dāng)年生春梢（木質(zhì)化）及秋梢（未木質(zhì)化），帶回實(shí)驗(yàn)室仔細(xì)剪掉其針葉及萌生的小側(cè)枝，并剪成長約2 cm的莖段，用0.5%洗衣粉溶液浸泡5 min，并輕柔搓洗15 min，再用自來水沖洗30 min，置于超凈工作臺備用。

1.2.2 中山杉腋芽啟動試驗(yàn) 2017年6月7日采集當(dāng)年生半木質(zhì)化嫩梢為試驗(yàn)對象，預(yù)處理方法同上。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 外植體消毒試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用3因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以枝條類型、HgCl2濃度及其處理時間為試驗(yàn)因素，其中枝條類型和HgCl2濃度設(shè)2水平，HgCl2處理時間設(shè)3水平（表1）。

表1 外植體消毒試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

Table 1 Different treatments of disinfection of explants

1.3.2 腋芽啟動試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以NAA（A），6-BA（B），活性炭（C）為因素，每因素設(shè)3個水平，得到L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表2）。

表2 腋芽啟動正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）

Table 2 Experiment on germination of axillary bud by orthogonal design L9（34）

1.4 試驗(yàn)步驟及培養(yǎng)條件

1.4.1 外植體消毒試驗(yàn) 將已經(jīng)預(yù)處理好的枝條用75%酒精處理30 s后用無菌水漂洗3次，再按表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行消毒，最后用無菌水沖洗4次，濾干后進(jìn)行接種。每處理接種10瓶，每瓶接1個外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)基為MS，6.5 g·L-1瓊脂粉，30.0 g·L-1蔗糖，pH值調(diào)節(jié)至5.8 ~ 6.2，不添加植物生長劑；培養(yǎng)溫度25±1℃、光照強(qiáng)度2 000 ~ 2 500 lx、光照時間12 h·d-1。

1.4.2 腋芽啟動試驗(yàn) 外植體消毒方法及步驟同上，僅0.2% HgCl2處理時間固定為10 min。每處理接種30瓶，每瓶接1個外植體。培養(yǎng)條件同上。

1.5 數(shù)據(jù)記錄及處理

外植體消毒試驗(yàn)每隔5 d采集1次數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄4次。記錄外植體污染發(fā)生類型、部位及數(shù)量，腋芽初始萌動時間、萌動程度、材料的生理狀態(tài)（是否褐化、玻璃化）等情況。腋芽啟動試驗(yàn)記錄每隔10 d采集1次數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄4次，記錄腋芽萌動情況，腋芽啟動標(biāo)準(zhǔn)為腋芽打破休眠，出現(xiàn)芽體積變大及逐漸變綠現(xiàn)象。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算污染率、啟動率等，公式如下：

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對中山杉外植體污染率的影響

由表3可以看出，以春梢（木質(zhì)化）作為外植體的6個處理在接種后5 d時就出現(xiàn)大量外植體霉菌污染，在接種后10 d就全部污染；而以秋梢（未木質(zhì)化）作外植體的6個處理在接種后5 d時，僅有零星污染，在隨后的10 d，15 d，20 d觀察中新增污染數(shù)也極少，20 d時，7－12號處理平均污染率僅為12.2%，污染率最高的7號處理也僅為26.7%，而11號處理污染率為0。20 d時7－12號處理的外植體平均啟動率達(dá)90%以上，9，10號處理啟動率為100%，最低的12號處理為75.9%。

表3 外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Effect of different disinfection on contamination rate of explants

注：*表示的數(shù)值特指腋芽已萌動的外植體數(shù)，不是已萌動腋芽的數(shù)量。

通過方差分析得出枝條類型、HgCl2濃度、HgCl2處理時間以及枝條類型與HgCl2濃度、枝條類型與HgCl2處理時間對外植體消毒效果差異極顯著（＜0.01，表4）。進(jìn)一步進(jìn)行各因素的差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，春梢與秋梢2水平間差異極顯著（＜0.01），0.1% HgCl2與0.2% HgCl22水平之間差異顯著（＜0.05），HgCl2處理8 min與10 min及12 min之間顯著（＜0.05），而HgCl2處理10 min與12 min之間不顯著。由此得出選用未木質(zhì)化嫩梢作為外植體，用0.2% HgCl2處理10 min為佳。

表4 消毒試驗(yàn)方差分析

Table 4 ANOVA on disinfection effect

注：**表示差異極顯著。

2.2 不同培養(yǎng)基對外植體腋芽啟動培養(yǎng)的影響

接種后10 d觀察時就有部分外植體的腋芽開始萌動，出現(xiàn)芽體變大變綠現(xiàn)象，到20 d時尤為突出，但到30 d時腋芽萌動的外植體新增現(xiàn)象減緩，此時大量腋芽開始展葉并生長，到40 d時腋芽進(jìn)入伸長生長階段，部分嫩梢長度達(dá)1.0 ~ 1.5 cm。

通過極差分析（表5）可知，各因素作用的主次順序?yàn)锽>A>C，即6-BA對中山杉腋芽萌動起主導(dǎo)作用，其次是NAA，而活性炭對腋芽萌動有抑制作用，隨著活性炭濃度增加，腋芽萌動越困難。理論上得出適合中山杉腋芽啟動培養(yǎng)的最優(yōu)組合為B3A3C1，即MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1。值得注意的是40 d時觀察發(fā)現(xiàn)8，9號處理雖然啟動率很高，但芽體過于膨大且萌發(fā)時間較晚，最早的都需要30 d，存在新芽長度短，新芽展葉慢等特點(diǎn)。

表5 腋芽啟動正交試驗(yàn)分析

Table 5 Orthogonal test for germination of axillary bud

6號處理表現(xiàn)則較好，首先腋芽萌動早且芽體也較飽滿，到40 d時最長的嫩梢達(dá)到1.5 cm（見圖1）。從成本、育苗時間考慮，以枝條為外植體的最佳組合可調(diào)整為B3A2C1，即MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1。

圖1 40 d時中山杉腋芽啟動情況（左：6號處理，右：1號處理）曹劍攝

Figure 1 Growth of axillary bud 40 days later of treatment

3 結(jié)論與討論

在中山杉外植體消毒的一系列前期試驗(yàn)中，外植體的污染率都一直居高不下，特別是在2017年9－10月先后進(jìn)行的外植體消毒試驗(yàn)，最終在接種后10 d時都全部污染。通過試驗(yàn)觀察及查閱文獻(xiàn)資料[7-10]后推測，已經(jīng)木質(zhì)化的健壯枝條為外植體其自身帶菌量太多導(dǎo)致消毒不徹底，此次試驗(yàn)充分證實(shí)了上述推測。可以看到木質(zhì)化枝條由于生長時間長，長期暴露在外，加之隨著時間的推移枝條的皮層縱裂明顯，容易滋生大量雜菌且不易去除；而未木質(zhì)化的枝條，由于暴露在外的時間較短，加之枝條皮層光滑未曾開裂，雜菌不易滋生及附著，因此在消毒過程中能徹底清除雜菌。觀察中也發(fā)現(xiàn)用0.2% HgCl2處理12 min后，外植體啟動率最低，且未啟動的外植體都出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象，這與HgCl2處理時間較長導(dǎo)致腋芽受損重有關(guān)系[8,11-12]。

眾所周知，木本植物無菌體系建立時外植體消毒技術(shù)很難把控，而目前的資料表明僅唐興國等[6]開展了中山杉外植體消毒試驗(yàn)，但該試驗(yàn)方法其外植體預(yù)培養(yǎng)時間相對較長，試驗(yàn)效果方面雖然污染率可低至6.7%，但外植體的存活率也降至20%，這在實(shí)際生產(chǎn)上的指導(dǎo)意義不大。本試驗(yàn)外植體消毒試驗(yàn)中，外植體不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，通過對外植體類型、HgCl2濃度及處理時間進(jìn)行對比試驗(yàn)，其消毒試驗(yàn)結(jié)果甚為理想，在實(shí)際生產(chǎn)上有節(jié)省時間、可操作性強(qiáng)等實(shí)用價值。然而采用未木質(zhì)化嫩梢作為外植體，其萌動抽生的腋芽質(zhì)量不佳，芽體也較瘦弱，而采用木質(zhì)化的粗壯枝條作為外植體，其抽生的腋芽飽滿壯實(shí)。因此，針對木質(zhì)化中山杉枝條為外植體探索出一套行之有效的消毒方案，將會更有實(shí)際應(yīng)用價值。

腋芽啟動培養(yǎng)過程中，6-BA作為細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，表現(xiàn)出極為明顯的促進(jìn)作用，在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)芽的形成與生長；而NAA作為生長素類物質(zhì)，也能明顯促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞的生長，但當(dāng)濃度過高時則會抑制芽的產(chǎn)生，當(dāng)6-BA/NAA比值大時更有利于腋芽啟動，李慶偉等[7,13-14]也得出過相似的結(jié)論。但此次研究也發(fā)現(xiàn)在消毒試驗(yàn)中未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下，未木質(zhì)化嫩枝的腋芽啟動率為90%，但在后續(xù)觀察中發(fā)現(xiàn)幼芽黃綠且瘦弱，實(shí)際應(yīng)用價值不高；而腋芽啟動試驗(yàn)外植體采用的是春季萌生的半木質(zhì)化嫩枝，消毒難度較秋季萌生嫩枝更難，扣除外植體污染樣本數(shù)量后，一定程度上影響了腋芽啟動數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，但腋芽啟動率仍達(dá)到了87.5%，僅稍低于秋季嫩枝，同時，腋芽啟動試驗(yàn)所獲得的幼芽質(zhì)量極高。因此在后續(xù)的研究工作中，將進(jìn)一步對中山杉枝條木質(zhì)化程度、枝條萌發(fā)季節(jié)等納入因素進(jìn)一步深入研究。

中山杉無菌體系的建立尤為重要，特別是外植體的消毒是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。試驗(yàn)表明外植體以未木質(zhì)化、表皮無裂紋的新梢為佳，以0.2% HgCl2處理時間10 min為好，接種20 d時外植體污染率為0，且啟動率也達(dá)90%。在中山杉啟動培養(yǎng)中，腋芽萌動集中出現(xiàn)在接種后10 ~ 20 d，30 d時腋芽便開始展葉及伸長生長。通過正交試驗(yàn)得出NAA，6-BA對其腋芽萌動都有促進(jìn)作用，其中6-BA起主導(dǎo)作用，而活性炭則相反，對中山杉腋芽萌動有抑制作用。中山杉外植體腋芽啟動培養(yǎng)的最佳組合是MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。

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Preliminary Test on Establishment of Sterile Culture of‘Zhongshanshan’

Huang Zhi-wei，Cao Jian

（Chongqing Three Gorges Polytechnic College, Chongqing 404155, China）

Current spring and autumn shoots of 8-year‘Zhongshanshan’ were collect on 16 November of 2017 at cutting orchard in Chongqing for test of sterile culture of explant and axillary bud germination. Sterile culture test was designed by randomized block of three factors, namely type of shoot, concentration and treatment time of HgCl2. The results showed that the best sterile culture of explant was autumn shoot treated by 0.2% HgCl2for 10 minutes, with contamination rate of 0. Axillary bud germination test was designed by orthogonal of L9(34), with NAA, 6-BA and activated carbon as factors. The results indicated that NAA and 6-BA had the positive effect on germination of axillary bud, especially 6-BA, while activated carbon had inhibitory effect. The optimal medium of bud germination was MS + 1.0 mg?L-1of 6-BA + 0.5 mg?L-1NAA.

‘Zhongshanshan’; sterile culture; explant disinfection; axillary bud germination

S791

A

1001-3776（2018）05-0061-06

2018-03-29；

2018-07-15

重慶市高職院校新技術(shù)推廣項(xiàng)目-三峽庫區(qū)消落帶植被恢復(fù)中山杉118良種中試與示范（GZTG201611）

黃志偉，工程師，從事林業(yè)生態(tài)工程研究；E-mail：475221232@qq.com。

曹劍，副教授，從事森林病蟲害及林業(yè)生態(tài)相關(guān)研究；E-mail：407586199@qq.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.010