柴樸湯對(duì)哮喘大鼠肺組織MAL/MAPK/ERK通路的影響*

劉鑫，劉穆華，羅淑瑛

[1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院（南華大學(xué)第一臨床學(xué)院） 中醫(yī)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖南 婁底 417000]

哮喘是一種具有多種發(fā)病機(jī)制的疾病，與過(guò)敏有關(guān)，是遺傳和環(huán)境相互作用的結(jié)果，哮喘被定義為氣道慢性炎癥[1]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的一種，可以在很多細(xì)胞中表達(dá)，ERK1/2是ERK的一種亞型，已證明主要分布在氣道平滑肌細(xì)胞上。研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路參與哮喘氣道慢性炎癥及黏液分泌等過(guò)程[2]。而前期研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清能誘導(dǎo)MAL表達(dá)下調(diào)，而柴樸湯含藥血清能使之表達(dá)增加，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)[3-4]。但柴樸湯是否能調(diào)控MAPK/ERK通路，減少炎癥因子的分泌，目前尚未有研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究柴樸湯是否能通過(guò)影響T細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白（MAL）及MAPK/ERK通路的表達(dá)來(lái)改善哮喘的炎癥反應(yīng)癥狀，為柴樸湯治療哮喘提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SD大鼠，體重（220±20）g，40只，購(gòu)于南華大學(xué)動(dòng)物部。卵蛋白（OVA）（美國(guó)Sigma公司），氫氧化鋁干粉（Al（OH）3）（廣州化學(xué)試劑廠），中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），PD98059（深圳欣博盛生物科技有限公司），兔抗p-ERK多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)公司），MAL抗體（北京博奧森），PCR引物、動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（上海碧云天研究所）。JSC-OK超聲波霧化器（遼寧省鞍山儀器廠），封閉霧化箱（自制），低溫超速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像分析儀（美國(guó)Alpha公司），PCR儀（廣州華粵公司）。

1.2 哮喘模型的復(fù)制

將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：哮喘組、柴樸湯組、柴樸湯+MAPK/ERK通路抑制劑（PD98059）（柴抑組）、對(duì)照組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按照參考文獻(xiàn)[5]復(fù)制哮喘模型。除對(duì)照組外，其余各組均予以O(shè)VA 1 mg+Al（OH）3100 mg+生理鹽水混合液1 ml于第1和8天腹腔注射致敏。自第15天開始，置于自制的霧化箱中，用霧化器將1% 1 mg+Al（OH）3 100 mg+生理鹽水霧化吸入激發(fā)30 min，隔天1次，共8周。以大鼠出現(xiàn)呼吸節(jié)律紊亂、耳、尾及口唇紫紺、不喜活動(dòng)代表模型復(fù)制成功。對(duì)照組用生理鹽水代替。在哮喘組基礎(chǔ)上，自第15天開始，柴樸湯組每次霧化前30 min予以柴樸湯（1.5 g/kg）2 ml灌胃，柴抑組每次霧化前30 min予以PD98059（3 mg/kg）[6]腹腔注射，同時(shí)給予柴樸湯（1.5 g/kg）2 ml灌胃。末次霧化24 h后，予以10%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，用RT-PCR檢測(cè)肺組織中MAL mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）檢測(cè)MAL、p-ERK1/2蛋白在肺組織中的表達(dá)。

柴樸湯由柴胡（產(chǎn)品批號(hào)5090141）、半夏（批號(hào) 50933781）、黃芩（批號(hào)505020T）、茯苓（批號(hào)5092201）、厚樸（批號(hào)412390T）、大棗（批號(hào) 5083021）、甘草（批號(hào)5090751）、白參（批號(hào)504321T）、蘇葉（批號(hào)412149T）、生姜（批號(hào)5074131）等中藥配方顆粒組成，由廣東一方制藥有限公司提供，按7∶5∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2∶1比例配制，1 g顆粒相當(dāng)于生藥6.8 g。生理鹽水沖泡，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病理學(xué)觀察 用4%中性甲醛固定肺組織后，取內(nèi)中帶的肺組織行常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡觀察肺組織的形態(tài)。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)MAL mRNA的表達(dá) 按一步法提取肺組織總RNA，引物的設(shè)計(jì)與合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。β-actin引物：PCR正向 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，反向 5'-CTC CTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度500 bp；MAL：正向 5'-AACAAAGTGGGAGATTGAGACCTA-3'，反向5'-GTATGGCTGGATAACCAAAGG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度185 bp?？偡磻?yīng)體系為20 μl。β-actin反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性5 min，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次，最終72℃延伸5 min，4℃臨時(shí)保存。MAL的反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性5 min，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)40次，最終72℃延伸5 min，4℃臨時(shí)保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，用Image J軟件分析各電泳條帶灰度值，以β-actin作為對(duì)照，對(duì)各組MAL mRNA進(jìn)行分析。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書操作：脫蠟、增加水分、密封、滴加MAL、p-ERK1/2、IL-4一抗、加二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒代表陽(yáng)性，測(cè)量陽(yáng)性顆粒的光密度（optical density, OD），計(jì)算其平均值代表MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理組織學(xué)改變

哮喘組大鼠肺組織可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞（以嗜酸性粒細(xì)胞為主）浸潤(rùn)，皺襞增多，上皮壞死、脫落，杯狀細(xì)胞黏液化生明顯，平滑肌及基底膜增厚，管壁增粗，管腔狹窄。柴樸湯組、柴抑組上述病變較哮喘組均有所減輕。對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，氣道上皮完整，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)改變 （HE×200）

2.2 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-actin的電泳條帶在500 bp處最亮，各組mRNA條帶亮度大致相當(dāng)。在185 bp處可見(jiàn)MAL mRNA電泳條帶，哮喘組mRNA條帶最暗，柴樸湯組、柴抑組、對(duì)照組依次增亮。見(jiàn)圖2。

哮喘組MAL mRNA的表達(dá)最少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均高于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組兩組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

圖2 MAL mRNA的電泳圖

表1 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的相對(duì)灰度值（±s）

表1 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的相對(duì)灰度值（±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與哮喘組比較，P ＜0.05

組別 n MAL mRNA哮喘組 10 0.30±0.011）柴樸湯組 10 1.00±0.031）2）抑制劑組 10 1.00±0.071）2）對(duì)照組 10 1.70±0.13 F值 189.118 P值 0.000

2.3 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，4組大鼠均可見(jiàn)MAL蛋白陽(yáng)性的棕黃色顆粒細(xì)胞，哮喘組MAL 蛋白的表達(dá)最少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均高于哮喘組（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3和表2。

對(duì)照組未見(jiàn)明顯p-ERK1/2蛋白陽(yáng)性棕黃色顆粒，其余各組大鼠均可見(jiàn)p-ERK1/2蛋白陽(yáng)性棕黃色顆粒，主要位于支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。哮喘組p-ERK1/2蛋白表達(dá)最多，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均低于哮喘組（P＜0.05）；柴抑組低于柴樸湯組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4和表2。

圖3 各組大鼠MAL蛋白的表達(dá) （免疫組化×200）

圖4 各組大鼠p-ERK1/2蛋白的表達(dá)（免疫組化×200）

表2 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

表2 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與哮喘組比較，P ＜0.05；3）與柴樸湯組比較，P ＜0.05

組別 n MAL p-ERK1/2 IL-4哮喘組 10 0.30±0.031） 0.60±0.031） 1.50±0.041）柴樸湯組 10 0.60±0.051）2） 0.40±0.061）2） 0.60±0.091）2）柴抑組 10 0.70±0.061）2） 0.20±0.012）3） 0.40±0.041）2）3）對(duì)照組 10 1.1±0.06 0.1±0.03 0.1±0.02 F值 348.506 112.737 568.622 P值 0.000 0.000 0.000

哮喘組IL-4蛋白表達(dá)最多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均低于哮喘組（P＜0.05）；柴抑組低于柴樸湯組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5和表2。

圖5 各組大鼠IL-4蛋白的表達(dá) （免疫組化×200）

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性肺部疾病，近幾十年來(lái)全球發(fā)病率一直在上升。目前臨床治療哮喘的主要藥物是糖皮質(zhì)激素，它主要能降低炎癥細(xì)胞的聚集及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，但長(zhǎng)期使用容易并發(fā)感染，甚至誘發(fā)激素抵抗。而中藥可以減慢哮喘的加重，使哮喘患者的病情好轉(zhuǎn)，減少因糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為哮喘主要的發(fā)病機(jī)制是外因觸發(fā)，痰堵氣道，痰氣交阻[7]。柴樸湯由小柴胡湯和半夏厚樸湯組成，有理氣、減輕氣道重構(gòu)的作用，是針對(duì)發(fā)病機(jī)制治療哮喘的有效方劑。

MAL最初由ALONSO等[8]在T細(xì)胞分化晚期發(fā)現(xiàn)，是一種高度疏水蛋白，位于細(xì)胞外圍，參與上皮細(xì)胞的吸收和分泌。研究表明，MAL在多種腫瘤細(xì)胞（如乳腺癌、胃癌、宮頸癌及頭頸鱗狀細(xì)胞癌）中均有表達(dá)，它能穩(wěn)定上皮細(xì)胞的極性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)育和轉(zhuǎn)移[9-10]。MAL還可以通過(guò)維持宿主器官的屏障功能而起到保護(hù)宿主的作用。屏障主要是指由細(xì)胞結(jié)合于黏膜上從而形成的緊密連接的線性排列，是具有保護(hù)作用的隔離層，屏障功能破壞將導(dǎo)致炎癥及細(xì)菌的擴(kuò)散。而哮喘炎癥反應(yīng)的源頭是上皮細(xì)胞損傷以及修復(fù)機(jī)制受損[11]，進(jìn)而上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性減弱，屏障功能被破壞。前期已經(jīng)通過(guò)基因研究證實(shí)，哮喘大鼠模型中MAL基因的表達(dá)下調(diào)，且時(shí)間越長(zhǎng)其表達(dá)約低，說(shuō)明MAL在哮喘的起病及進(jìn)展中起著重要作用[12]。而柴樸湯通過(guò)使MAL的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使哮喘大鼠氣道更加穩(wěn)定，癥狀隨之減輕[3]。

ERK是一類常見(jiàn)的蛋白激酶，是MAPKs成員之一。ERK包括ERKl和ERK2，活化后的ERK1/2即為p-ERK1/2，其進(jìn)入細(xì)胞核后作用于ATF、AP-1、TNF等炎癥因子，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而誘導(dǎo)促炎因子與炎癥介質(zhì)的合成與釋放[13]。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號(hào)通路參與哮喘的病理發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其可使哮喘的氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程加重[14]。楊紅菊等[15]使用低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞復(fù)制細(xì)胞低氧模型中，發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2水平增加，黏蛋白MUC5AC過(guò)度生成和分泌，提示低氧可以誘導(dǎo)ERK1/2通路的激活，導(dǎo)致氣道黏液高分泌，表明ERK1/2通路涉及氣道炎癥及氣道黏液分泌過(guò)程。張?jiān)萚16]實(shí)驗(yàn)表明，IL-33通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)哮喘小鼠的氣道重塑，阻斷ERK1/2信號(hào)通路，可使哮喘的病變減輕。前期研究已經(jīng)證實(shí)，柴樸湯可以抑制哮喘大鼠肺組織中ERK信號(hào)通路的表達(dá)，從而減少平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生纖維連接蛋白，進(jìn)而抑制哮喘氣道重塑及氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞的失衡與哮喘發(fā)病密切相關(guān)[18]。而Th2細(xì)胞分泌的IL-4，其在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。IL-4能夠促進(jìn)Th細(xì)胞向Th2分化。它能刺激B細(xì)胞活化、增殖，產(chǎn)生抗體，從而參與體液免疫應(yīng)答，如調(diào)控B淋巴細(xì)胞，使其產(chǎn)生特異性IgE。IgE能夠結(jié)合在嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或血小板的特異性受體上，當(dāng)同種抗原再次暴露時(shí)，抗原與細(xì)胞表面特異性IgE交聯(lián)，從而導(dǎo)致炎癥釋放的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[19]。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組MAL mRNA和蛋白的表達(dá)最低；而在柴樸湯組和柴抑組中MAL mRNA和蛋白的表達(dá)均高于哮喘組，且肺組織病變較哮喘組減輕；柴樸湯組和柴抑組比較無(wú)差異。哮喘組MAL表達(dá)最低，柴樸湯能夠使MAL表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而減輕哮喘大鼠的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，這與筆者前期研究的結(jié)果一致。而MAPK/ERK通路抑制劑PD98059對(duì)MAL的表達(dá)無(wú)抑制作用，說(shuō)明MAL是ERK通路的上游信號(hào)因子。另外，在哮喘組中，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，提示在哮喘狀態(tài)下ERK1/2被磷酸化激活，ERK通路參與了哮喘的起病過(guò)程。而p-ERK1/2蛋白的表達(dá)在柴樸湯組和柴抑組中均低于哮喘組，說(shuō)明柴樸湯能抑制ERK1/2的磷酸化，減輕哮喘的氣道炎癥，延緩哮喘的加重。同時(shí)，哮喘組大鼠IL-4蛋白表達(dá)最高，與對(duì)照組比較有差異。而柴樸湯及抑制劑干預(yù)后，IL-4表達(dá)減少。且柴抑組下降更明顯，提示柴樸湯能夠抑制IL-4的表達(dá)，其可能是通過(guò)ERK通路實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果表明，柴樸湯可以上調(diào)哮喘大鼠肺組織中MAL的表達(dá)，進(jìn)而抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，減少IL-4的表達(dá)，從而減輕哮喘炎癥反應(yīng)，這可能是柴樸湯治療哮喘的機(jī)制之一。