一株新型自絮凝凱式擬小球藻的兩步培養(yǎng)產(chǎn)油技術(shù)

趙 艷 汪 成 王超霞 王天圻

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 杭州 310018)

以小球藻為代表的微藻是一類能進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)的單細(xì)胞綠藻, 具有光合作用效率高、生長(zhǎng)速度快、適合工業(yè)化養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn), 微藻油脂含量比大豆、棕櫚樹、油菜等傳統(tǒng)油料作物更高, 可達(dá)到50%—70%細(xì)胞干重, 是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)異可再生資源[1]。隨著化石能源逐漸耗竭, 微藻被認(rèn)為是唯一可完全替代化石能源的生物柴油新原料[2]。獲取優(yōu)良藻株和建立高效的人工培養(yǎng)技術(shù)體系是當(dāng)前微藻生物柴油研發(fā)的重點(diǎn), 其中藻細(xì)胞生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)率是微藻培養(yǎng)中的3個(gè)關(guān)鍵參數(shù)[3]。理想的培養(yǎng)技術(shù)體系應(yīng)保障藻細(xì)胞生物量和油脂含量同時(shí)達(dá)到峰值, 但實(shí)際上兩個(gè)指標(biāo)通常難以同步, 因?yàn)樯锪康奶岣咄ǔＲ蕾囉跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充足供應(yīng), 而脂質(zhì)積累大多發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)元素限制的應(yīng)激條件下[4]。為了解決上述矛盾, 研究者設(shè)計(jì)了兩步培養(yǎng)法[5,6], 即階段Ⅰ藻細(xì)胞在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)達(dá)到較高生物量, 階段Ⅱ轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)元素限制培養(yǎng)基以刺激藻細(xì)胞的油脂合成。Mujtaba等[7]通過(guò)補(bǔ)充CO2和低氮脅迫兩步培養(yǎng)法使普通小球藻的油脂產(chǎn)率提高到傳統(tǒng)單步培養(yǎng)法的2.45倍。李小妹等[8]報(bào)道兩步培養(yǎng)法使柵藻生物量和油脂含量分別比單步培養(yǎng)法提高了35.74%和近1倍。兩步培養(yǎng)法優(yōu)勢(shì)明顯, 但尚處于探索階段。階段Ⅰ提高藻細(xì)胞生物量的方法包括添加有機(jī)碳源、通CO2氣體、補(bǔ)充激素、提高光照強(qiáng)度等[9,10], 其中添加葡萄糖能使微藻處于自養(yǎng)和異養(yǎng)共存的兼養(yǎng)模式, 既能提高藻細(xì)胞生物量, 又能顯著增加油脂含量, 從而大幅提高微藻油脂產(chǎn)率[11,12]。階段Ⅱ提高藻細(xì)胞油脂含量的理論基礎(chǔ)在于營(yíng)養(yǎng)元素限制改變微藻的代謝模式并影響油脂合成, 具體方法包括氮、硫、磷等單種元素限制或稀釋培養(yǎng)基進(jìn)行全營(yíng)養(yǎng)元素限制等[4,13]。但藻種不同提高油脂產(chǎn)率所需的培養(yǎng)條件也不同, 如小球藻NJ-18在氮、磷限制時(shí)油脂產(chǎn)率較高[14], 普通小球藻CCALA256在全營(yíng)養(yǎng)元素限制時(shí)油脂產(chǎn)率較高[15]。因此針對(duì)特定藻種進(jìn)行兩步培養(yǎng)法的技術(shù)優(yōu)化, 實(shí)現(xiàn)生物量與油脂含量的協(xié)同增效是構(gòu)建微藻油脂生產(chǎn)體系的關(guān)鍵。此外, 由于微藻細(xì)胞體積小、收獲困難, 傳統(tǒng)的機(jī)械過(guò)濾和離心等物理收集方法的成本高達(dá)微藻油脂生產(chǎn)總成本的20%—30%, 化學(xué)絮凝收集法中絮凝劑的使用又會(huì)造成環(huán)境污染和生物毒害[16], 這無(wú)疑增加了兩步培養(yǎng)法的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)成本, 限制了其應(yīng)用。優(yōu)良的自絮凝微藻在不添加任何絮凝劑的條件下即可自發(fā)絮凝, 易于收獲且無(wú)需增加額外經(jīng)濟(jì)成本[17], 與兩步培養(yǎng)法結(jié)合, 有望成為解決微藻生物柴油生產(chǎn)技術(shù)瓶頸的新突破口。

本課題組篩選獲得一株凱式擬小球藻(Parachlorella kessleri)優(yōu)良藻株F01, 自養(yǎng)條件下油脂含量達(dá)到30%左右, 且具有很強(qiáng)的自絮凝能力, 在微藻油脂生產(chǎn)方面應(yīng)用潛力較大。本文針對(duì)兩步培養(yǎng)法的階段Ⅰ葡萄糖兼養(yǎng)培養(yǎng)和階段Ⅱ的元素限制處理?xiàng)l件進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化, 為新型自絮凝凱式擬小球藻F01應(yīng)用于生物柴油開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

凱式擬小球藻藻種F01由本實(shí)驗(yàn)室從水生植物根際土壤分離鑒定并保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

凱式擬小球藻F01的兩步培養(yǎng)法方案階段Ⅰ培養(yǎng): 以BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基[18]為自養(yǎng)培養(yǎng)基作為單步培養(yǎng)對(duì)照, BG11中添加4種不同初始濃度(1、5、10和20 g/L)的葡萄糖作為兩步培養(yǎng)法的兼養(yǎng)培養(yǎng)基, 分裝到250 mL三角瓶中, 裝液量為100 mL。挑取單藻落純化后自養(yǎng)擴(kuò)培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的F01作為種子細(xì)胞, 藻細(xì)胞接種后初始濃度均為2×106cell/mL, 置于人工氣候箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為: 25℃, 光強(qiáng)40 μmol/(m2.s), 光周期中光暗比L∶D為12h∶12h, 每天早晚各搖動(dòng)一次。每組設(shè)置3個(gè)平行, 培養(yǎng)周期為10d。

階段Ⅱ元素限制培養(yǎng): 將階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)10d至穩(wěn)定期的F01藻細(xì)胞按初始濃度1×107cell/mL轉(zhuǎn)接至元素限制培養(yǎng)基進(jìn)行階段Ⅱ培養(yǎng), 培養(yǎng)條件同階段Ⅰ。元素限制培養(yǎng)基以階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ), 設(shè)置不同濃度起始碳源、氮源和營(yíng)養(yǎng)元素及其相關(guān)組合, 具體包括: (1)糖限制組: 1/10 G低糖組, 即將階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度由10降低至1 g/L; 0 G無(wú)糖組, 即BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基。(2) 低糖低氮組: BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1 g/L的葡萄糖并將氮素硝酸鈉由1.5減少至0.5 g/L (1/10G+1/3N)。(3)無(wú)糖氮限制組: 1/3N低氮組, 即BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉減為0.5 g/L; 0N無(wú)氮組,BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去除硝酸鈉。(4)全元素限制組: BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋為原來(lái)的1/3。

藻細(xì)胞計(jì)數(shù)和生物量測(cè)定階段Ⅰ和階段Ⅱ培養(yǎng)中分別每2d或1d取樣一次, 取樣時(shí)間均為光照10h后, 藻細(xì)胞濃度的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法, 為了避免自絮凝特性對(duì)計(jì)數(shù)效果的影響, 取樣計(jì)數(shù)前將培養(yǎng)液震蕩搖勻保證計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。離心收集適量藻細(xì)胞并烘干至恒重, 計(jì)算干重生物量和干重產(chǎn)率。

藻細(xì)胞油脂提取和含量的測(cè)定采用溶劑提取法和脂染色法對(duì)凱式擬小球藻油脂含量進(jìn)行測(cè)定, 并建立凱式擬小球藻油脂含量與脂染色后吸光度在A645nm的線性回歸方程, 采用脂染色法測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中的油脂。溶劑提取法具體操作參考Zhao等[19]的方法, 脂染色法具體操作參照任潔等[20]的方法。

油脂產(chǎn)率按照如下公式計(jì)算:

F01藻細(xì)胞絮凝率測(cè)定參照Alam等[21]的方法并稍作修改。測(cè)定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)液以使藻細(xì)胞分散均勻, 然后將10 mL細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到試管中搖勻并測(cè)定藻細(xì)胞總濃度A (cell/mL), 將培養(yǎng)液分別靜置0.5、1、2、3、6和12h后, 在距離液面頂部4 cm處取細(xì)胞懸液試樣, 測(cè)量試樣藻細(xì)胞濃度B(cell/mL)。絮凝率按照如下公式計(jì)算:

藻EPS的提取與三維熒光光譜分析小球藻胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)的提取與分析參照Yang等[22]的方法。在培養(yǎng)周期結(jié)束后, 取藻細(xì)胞干重相當(dāng)于0.1 g的微藻懸浮液, 8000 r/min離心10min, 棄上清, 用5 mL去離子水洗滌沉淀, 8000 r/min離心5min, 收集的微藻沉淀用5 mL去離子水懸浮并加熱至80°C, 水浴30min。隨后, 將混合物以8000 r/min離心10min, 將上清液用0.45 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾, 濾液即EPS組分。

三維熒光光譜(3D-EEM)的測(cè)定條件參照Lv等[23]的方法。使用150 W氙弧燈為激發(fā)光源, 光電倍增管(PMT)電壓為700 V; 設(shè)定激發(fā)狹縫寬度為10 nm,發(fā)射狹縫寬度為1 nm。光譜儀掃描范圍為激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)(EX/EM)= 200—450 nm /250—550 nm,掃描速度為1200 nm/min。得到每個(gè)EX /EM所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度(Intensity, 單位: arbitary units, a.u.), 對(duì)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)采用Origin9.0軟件進(jìn)行處理, 形成等高線熒光光譜圖。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)3次重復(fù), 各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果以x±s (平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示,應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)對(duì)照和各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。采集數(shù)據(jù)利用Origin9.0軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果

2.1 階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)凱式擬小球藻F01生長(zhǎng)和油脂含量的影響

與自養(yǎng)對(duì)照組相比, 兼養(yǎng)組中葡萄糖濃度在1—20 g/L內(nèi)對(duì)F01促生長(zhǎng)效應(yīng)明顯(圖 1A)。培養(yǎng)8—10d, 添加5—20 g/L葡萄糖培養(yǎng)組藻細(xì)胞生長(zhǎng)開始進(jìn)入穩(wěn)定期, 對(duì)照組仍處于對(duì)數(shù)期; 至10d培養(yǎng)期結(jié)束時(shí), 所有兼養(yǎng)組藻細(xì)胞濃度均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組, 其中10和20 g/L葡萄糖兼養(yǎng)組藻細(xì)胞濃度較大, 分別為對(duì)照組的3.59倍和3.50倍, 二者差異不顯著。

第10天收獲藻細(xì)胞, 測(cè)定藻細(xì)胞的干重和油脂的含量, 結(jié)果如圖 1B, 兼養(yǎng)組藻細(xì)胞干重均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組, 其中10 g/L葡萄糖兼養(yǎng)組藻細(xì)胞干重達(dá)到3.54 g/L, 是對(duì)照組的6.94倍, 對(duì)比藻細(xì)胞濃度增幅(3.59倍)可知, 兼養(yǎng)培養(yǎng)促進(jìn)藻細(xì)胞干物質(zhì)積累效應(yīng)更顯著。10 g/L葡萄糖兼養(yǎng)組藻細(xì)胞油脂含量57.7%, 同比是對(duì)照組的2.35倍, 說(shuō)明兼養(yǎng)培養(yǎng)有利于藻細(xì)胞的生物量提高和油脂積累。綜合藻細(xì)胞生物量與油脂含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo), 選擇10 g/L葡萄糖作為階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)化碳源。由于第10天兼養(yǎng)組藻細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期, 故階段Ⅰ培養(yǎng)周期選擇為10d。

2.2 階段Ⅱ不同元素限制處理對(duì)凱式擬小球藻F01油脂產(chǎn)率的影響

階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)10d后的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接至元素限制培養(yǎng)基進(jìn)行階段Ⅱ培養(yǎng), 比較了葡萄糖限制、氮素限制和全元素限制等三類元素限制處理對(duì)F01藻細(xì)胞濃度(圖 2A)、干重(圖 2B)和油脂含量(圖 2C)的影響。結(jié)果表明, 三類營(yíng)養(yǎng)元素限制處理對(duì)藻細(xì)胞的生物量和油脂含量影響較大, 顯著(P＜0.05)改變了藻細(xì)胞的油脂產(chǎn)率。轉(zhuǎn)接后的前2d, 所有處理組的藻細(xì)胞均快速生長(zhǎng), 但藻細(xì)胞油脂含量與轉(zhuǎn)接前起始含量(油脂含量57.7%)相比均出現(xiàn)明顯下降,第1天尤其明顯。這說(shuō)明藻細(xì)胞從階段Ⅰ兼養(yǎng)富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入階段Ⅱ的營(yíng)養(yǎng)元素限制培養(yǎng)基后,短期內(nèi)物質(zhì)代謝發(fā)生了適應(yīng)性調(diào)節(jié)變化。

葡萄糖限制在階段Ⅱ5d培養(yǎng)過(guò)程中, 低糖組(1/10 G)和無(wú)糖組(0 G)的藻細(xì)胞濃度(圖 2A)和干重(圖 2B)持續(xù)增長(zhǎng), 第4天均到達(dá)穩(wěn)定期, 此時(shí)低糖組和無(wú)糖組的藻細(xì)胞濃度分別為初始轉(zhuǎn)接濃度的1.99和1.88倍, 二者差異不顯著, 但低糖組藻細(xì)胞干重(2.01 g/L)極顯著(P＜0.01)高于無(wú)糖組(1.48 g/L)。低糖組和無(wú)糖組的藻細(xì)胞油脂含量持續(xù)下降, 4d時(shí)低糖組油脂含量顯著(P＜0.05)高于無(wú)糖組。可見低糖限制處理比較利于藻細(xì)胞干重積累和油脂含量維持。

圖 1 階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)凱式擬小球藻F01生物量和油脂含量的影響Fig. 1 The effect of mixotrophic conditions at stageⅠon cell concentration, biomass and lipid contents of Parachlorella kessleri F01

圖 2 階段Ⅱ培養(yǎng)對(duì)凱式擬小球藻F01細(xì)胞濃度(A)、干重(B)和油脂含量(C)的影響Fig. 2 Effect of stage Ⅱ culture conditions on cell concentration (A), biomass (B) and lipid contents (C) of Parachlorella kessleri F01

氮素限制氮素限制處理(1/3N和0N)對(duì)F01細(xì)胞濃度和干重的影響與低糖處理組類似(圖 2A和2B), 總體上介于葡萄糖限制處理和全元素限制處理之間, 且低氮組均顯著(P＜0.05)高于無(wú)氮組,4d穩(wěn)定期時(shí)低氮組細(xì)胞干重為無(wú)氮組的1.28倍。轉(zhuǎn)接后前2d, 氮限制處理組藻細(xì)胞油脂含量下降幅度比葡萄糖限制組更大, 但分別于第2和第3天達(dá)到最低值, 之后開始回升。4d時(shí)低氮組油脂含量回升至41.3%, 超過(guò)無(wú)糖組, 同比與低糖組(40.2%)類似, 相當(dāng)于轉(zhuǎn)接前起始含量的71.5%; 無(wú)氮組油脂含量也回升至與無(wú)糖組相當(dāng)?shù)乃?。藻?xì)胞油脂含量出現(xiàn)回升拐點(diǎn)是氮素限制處理的顯著特征。

全元素限制采用1/3 BG11培養(yǎng)基進(jìn)行全元素限制處理時(shí), 藻細(xì)胞濃度和干重增長(zhǎng)最為緩慢,4d時(shí)到達(dá)1.63E+07 cell/mL和1.04 g/L (圖 2A和2B),比初始轉(zhuǎn)接時(shí)分別增加了63.0%和48.6%, 達(dá)到顯著差異(P＜0.05)水平。藻細(xì)胞油脂含量變化趨勢(shì)與低氮組相似(圖 2C), 回升拐點(diǎn)出現(xiàn)在第2天, 4d時(shí)藻細(xì)胞油脂含量與無(wú)糖組、無(wú)氮組相近, 無(wú)顯著性差異。

低糖低氮協(xié)同處理基于上述低糖處理提高藻細(xì)胞干重生物量和低氮處理后藻細(xì)胞油脂含量出現(xiàn)回升拐點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 設(shè)計(jì)考察了低糖與低氮協(xié)同處理(1/3N+1/10G)對(duì)藻細(xì)胞生物量、油脂含量的影響, 結(jié)果(圖 3)發(fā)現(xiàn)在協(xié)同處理后, 藻細(xì)胞干重和油脂含量變化趨勢(shì)與低氮組類似, 但同比介于低糖組與無(wú)糖組之間, 效果低于低糖處理組。

2.3 兩步培養(yǎng)法提高凱式擬小球藻F01油脂產(chǎn)率的效果評(píng)價(jià)

圖 3 低糖與低氮協(xié)同處理對(duì)凱式擬小球藻F01干重與油脂含量的影響Fig. 3 Effect of low glucose and low nitrogen co-treatment on biomass and lipid contents of Parachlorella kessleri F01

收獲期藻細(xì)胞干重和油脂含量決定了其最終的油脂產(chǎn)量, 而與培養(yǎng)時(shí)間關(guān)聯(lián)的油脂產(chǎn)率反映了平均每日的油脂收益。由于階段Ⅱ處理后藻細(xì)胞生物量逐漸增加并于4d達(dá)到穩(wěn)定期, 而油脂含量有所下降, 綜合考慮, 將單步培養(yǎng)法和兩步培養(yǎng)法階段Ⅱ處理1d和4d后收獲的藻細(xì)胞油脂產(chǎn)量及油脂產(chǎn)率總結(jié)于表 1?？芍獑尾椒ㄗ责B(yǎng)對(duì)照組的油脂產(chǎn)率僅為12.61 mg/(L.d), 兩步培養(yǎng)法經(jīng)階段Ⅰ兼養(yǎng)后藻細(xì)胞油脂產(chǎn)量(2.04 g/L)和油脂產(chǎn)率[204.25 mg/(L.d)], 分別是對(duì)照組的15.69倍和16.20倍, 增效十分顯著。經(jīng)階段Ⅱ的6種元素限制處理后, F01油脂產(chǎn)量和油脂產(chǎn)率出現(xiàn)較大變化, 雖然與單步法相比所有處理組藻細(xì)胞的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率均極顯著(P＜0.01)增加, 但與階段Ⅰ相比出現(xiàn)了增效與減產(chǎn)兩種技術(shù)結(jié)果。其中無(wú)氮組和全元素限制組油脂產(chǎn)量和油脂產(chǎn)率均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)低于階段Ⅰ, 說(shuō)明這兩種處理效果不佳。而低糖、無(wú)糖、低糖低氮組在處理1d時(shí)都顯著提高了F01的油脂產(chǎn)量, 并且4d時(shí)增效更顯著。其中低糖低氮協(xié)同處理4d后的油脂產(chǎn)量最高, 達(dá)到3.08 g/L, 同比是低氮組的1.39倍, 比單獨(dú)階段Ⅰ油脂產(chǎn)量增加了51.0%, 比單步法對(duì)照組增加了22.69倍。從油脂產(chǎn)率看, 階段Ⅱ低糖組處理1d的效果最佳, 達(dá)到242.64 mg/(L.d), 比階段Ⅰ提高了18.8%, 達(dá)到了單步法的19.24倍, 其次是低糖低氮協(xié)同處理組, 處理1d和4d的油脂產(chǎn)率均顯著高于階段Ⅰ, 增加幅度分別為11.4%和15.4%, 其他不添加葡萄糖的處理組油脂產(chǎn)率均顯著(P＜0.05)低于階段Ⅰ, 說(shuō)明葡萄糖兼養(yǎng)是影響F01的油脂產(chǎn)率的主要因素。

綜上, 兩步培養(yǎng)法對(duì)凱式擬小球藻F01的油脂生產(chǎn)促進(jìn)效果明顯, 階段Ⅰ兼養(yǎng)培養(yǎng)大幅提高了藻細(xì)胞的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率, 階段Ⅱ低糖處理和低糖低氮協(xié)同處理對(duì)進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率效果最佳。

2.4 兩步培養(yǎng)法對(duì)凱氏擬小球藻F01自絮凝性能的影響

收獲期F01自絮凝率分析在培養(yǎng)過(guò)程中,凱式擬小球藻自絮凝能力很強(qiáng), 藻細(xì)胞沉淀在培養(yǎng)瓶底部, 需人工振蕩才能懸浮起來(lái)。對(duì)照組培養(yǎng)10d的培養(yǎng)液靜置12h, 絮凝率為90.34%, 說(shuō)明F01具有良好的自絮凝性能。

兩步培養(yǎng)法階段Ⅰ培養(yǎng)結(jié)束時(shí)藻細(xì)胞自絮凝率為96.11%, 與對(duì)照組差異不顯著。階段Ⅱ中6種方式處理1d和4d后的藻細(xì)胞絮凝率結(jié)果如表 2?？梢婋A段Ⅱ處理后藻細(xì)胞的自絮凝率有所下降, 且4d時(shí)藻細(xì)胞的絮凝率同比1d時(shí)下降幅度較大, 但所有處理組藻細(xì)胞絮凝率均在80.0%以上。各處理組絮凝能力由大到小分別為: 低糖組＞低糖低氮組＞無(wú)糖組＞低氮組＞無(wú)氮組＞全元素限制組, 特別是對(duì)油脂產(chǎn)量和油脂產(chǎn)率具有顯著增效作用的低糖、無(wú)糖、低氮、低糖低氮處理組的藻細(xì)胞絮凝率基本在85.0%以上, 雖然與對(duì)照組或階段Ⅰ的差異達(dá)到顯著(P＜0.05)水平, 但仍能滿足自絮凝收獲的要求,收獲后上清液中剩余的藻細(xì)胞還可以作為下批次培養(yǎng)的種子細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)利用, 無(wú)需額外增加經(jīng)濟(jì)成本。

收獲期F01藻細(xì)胞EPS的組分分析藻細(xì)胞絮凝性能主要與EPS的組分和含量有關(guān), 圖 4顯示單步法對(duì)照組、兩步培養(yǎng)法階段Ⅰ和階段Ⅱ全元素限制處理4d后藻細(xì)胞EPS的三維熒光圖譜, 可知所有組藻細(xì)胞的EPS掃描均在區(qū)域T存在一個(gè)主峰(Ex/Em: 280/355 nm), 特征熒光峰的范圍基本相同。Chen等[24]對(duì)廢水中微生物胞外可溶性產(chǎn)物的三維熒光光譜特征進(jìn)行了詳細(xì)研究, 建立了三維熒光圖譜區(qū)域與不同類型有機(jī)物的對(duì)應(yīng)關(guān)系, 本文在相同試驗(yàn)條件下主要參照文獻(xiàn)的信息采用積分區(qū)域方法對(duì)試驗(yàn)藻細(xì)胞EPS的三維熒光光譜圖進(jìn)行解析, 可推測(cè)譜圖T區(qū)域溶解性藻細(xì)胞產(chǎn)物主要為蛋白樣類色氨酸物質(zhì), 由于色氨酸含有疏水性基團(tuán),EPS中蛋白樣類色氨酸物質(zhì)含量高可能是凱式擬小球藻F01具有良好絮凝性能的原因。圖 4峰T強(qiáng)度大小排列順序?yàn)锽＞A＞C, 對(duì)應(yīng)表 2藻細(xì)胞的自絮凝率大小排序?yàn)?6.11%＞90.34%＞82.07%。統(tǒng)計(jì)F01對(duì)照組、階段Ⅰ和Ⅱ處理不同天數(shù)后藻細(xì)胞EPS的峰T強(qiáng)度列于表 2, 進(jìn)一步說(shuō)明EPS中蛋白類色氨酸物質(zhì)含量高低與藻細(xì)胞絮凝率大小之間確實(shí)存在正相關(guān)。兩步培養(yǎng)法的不同培養(yǎng)基組成通過(guò)改變?cè)寮?xì)胞EPS蛋白類色氨酸物質(zhì)的含量而影響了其絮凝性能。

表 1 兩步培養(yǎng)法對(duì)凱式擬小球藻F01油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率的影響Tab. 1 Effect of two-step culture on lipid production and lipid productivity of Parachlorella kessleri F01

表 2 兩步培養(yǎng)法對(duì)凱式擬小球藻F01絮凝性能的影響Tab. 2 The effect of flocculating ability of Parachlorella kessleri F01 in culture under two-step culture

3 討論

本文采用的新型凱式擬小球藻F01具有光合自養(yǎng)與兼養(yǎng)生長(zhǎng)的能力, 兩步培養(yǎng)法階段Ⅰ添加葡萄糖兼養(yǎng)培養(yǎng)顯著提升了藻細(xì)胞生物量與油脂含量,10d收獲時(shí)藻油脂含量為57.7% (圖 1), 達(dá)到大多數(shù)傳統(tǒng)產(chǎn)油微藻(如普通小球藻、斜生柵藻、富油新綠藻)在條件綜合優(yōu)化后的40%—60%的油脂含量[4]。黃冠華等[5,25]報(bào)道蛋白核小球藻和普通小球藻兩步培養(yǎng)法中階段Ⅰ的最適葡萄糖用量為20 g/L,培養(yǎng)周期15d, 使油脂產(chǎn)率最大提高約2倍。Mujtabao等[7]和Ho等[26]報(bào)道產(chǎn)油微藻普通小球藻和斜生柵藻在兩步法培養(yǎng)后的油脂產(chǎn)率介于70—80 mg/L/d之間。本文中凱式擬小球藻F01階段Ⅰ兼養(yǎng)的最適葡萄糖濃度為10 g/L, 兩步培養(yǎng)法的階段Ⅱ低糖組處理1d的最大油脂產(chǎn)率最高達(dá)到242.64 mg/(L.d)(表 1), 是單步培養(yǎng)法對(duì)照組的19.24倍, 優(yōu)勢(shì)顯著,表明F01屬于生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)良潛力藻種。

油脂產(chǎn)率指標(biāo)綜合反映生產(chǎn)期內(nèi)每天的油脂收益, 受收獲藻細(xì)胞干重、油脂含量和培養(yǎng)周期的影響, 通過(guò)分解這3個(gè)重要參數(shù)可考察其對(duì)油脂產(chǎn)率貢獻(xiàn)的大小。本文發(fā)現(xiàn)階段Ⅱ的不同營(yíng)養(yǎng)元素限制處理對(duì)F01油脂產(chǎn)率的影響機(jī)制存在差異, 其中1/10G低糖處理1 d油脂產(chǎn)率達(dá)到峰值(表 1)的原因在于藻細(xì)胞干重增長(zhǎng)顯著且油脂含量相對(duì)階段Ⅰ而言下降幅度較小, 說(shuō)明該過(guò)程中藻細(xì)胞干重增加貢獻(xiàn)最大。除了全元素限制處理組外, 階段Ⅱ所有處理組的藻細(xì)胞在轉(zhuǎn)接后立即開始快速生長(zhǎng)(圖 2)。這與Ho等[26]在斜生柵藻兩步培養(yǎng)中的研究結(jié)論不同, 斜生柵藻在階段Ⅰ通入二氧化碳的培養(yǎng)中生長(zhǎng)迅速, 進(jìn)入階段Ⅱ營(yíng)養(yǎng)元素限制處理后藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢, 但油脂含量明顯提高, 最終油脂產(chǎn)率[78.73 mg/(L.d)]約為階段Ⅰ的2倍。原因可能是本文階段Ⅰ葡萄糖兼養(yǎng)后F01藻細(xì)胞本身的生化組分含量豐富, 能迅速適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。綜合分析階段Ⅰ葡萄糖兼養(yǎng)對(duì)藻細(xì)胞干重和油脂含量大幅提升, 以及階段Ⅱ低糖組、低糖低氮組油脂產(chǎn)率或產(chǎn)量較高(表 1)的技術(shù)效果, 可知補(bǔ)充有機(jī)碳源葡萄糖對(duì)F01藻種的生長(zhǎng)和油脂合成極為有利, 但直接添加葡萄糖的成本較高。營(yíng)養(yǎng)素限制處理的成本較低, 其中氮素限制處理應(yīng)用最為廣泛, 但技術(shù)效益隨藻種、環(huán)境條件和培養(yǎng)方式變化很大[13]。Li等[27]在自養(yǎng)條件下對(duì)凱式擬小球藻(CCALA255)進(jìn)行低氮處理, 4d內(nèi)藻細(xì)胞油脂含量逐漸上升。本文中低氮、無(wú)氮、低糖低氮協(xié)同處理5d內(nèi)藻細(xì)胞油脂含量均出現(xiàn)先下降后回升的拐點(diǎn)現(xiàn)象(圖2C),而生物量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐步增加至穩(wěn)定期(圖2A), 說(shuō)明氮素限制處理?xiàng)l件下F01在生物量增長(zhǎng)與油脂合成積累并不同步?？梢娽槍?duì)特定藻種通過(guò)基礎(chǔ)研究選擇微藻生物量與油脂含量的最佳平衡點(diǎn)極為重要, 油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率指標(biāo)技術(shù)含義不同,需要根據(jù)生產(chǎn)工藝和成本核算進(jìn)行優(yōu)化篩選。此外, Fu等[28]報(bào)道小球藻(Chlorella regularis)在葡萄糖異養(yǎng)培養(yǎng)和氮饑餓脅迫共同作用時(shí), 充足的磷元素使藻細(xì)胞油脂含量和產(chǎn)率分別達(dá)到對(duì)照組的2倍和1.3倍, Fernandes等[29]報(bào)道采用CO2通氣、元素限制培養(yǎng)處理和光照條件綜合優(yōu)化后的兩步培養(yǎng)技術(shù)能使凱式擬小球藻(CCALA255)藻細(xì)胞油脂含量提高4—5倍, 油脂產(chǎn)率最高達(dá)340 mg/(L.d)。磷元素及其他條件的優(yōu)化是否能進(jìn)一步提升F01的產(chǎn)油效益值得進(jìn)一步探究。

圖 4 凱式擬小球藻F01 的EPS三維熒光光譜Fig. 4 3D-EEM spectra of EPS of Parachlorella kessleri F01(white slanting part of the spectrum was due to the scattering effect by water molecules

在微藻生物柴油生產(chǎn)技術(shù)中, 傳統(tǒng)的藻細(xì)胞收獲方法如離心分離等巨大的能量和成本消耗是工程化應(yīng)用的主要限制, 尤其兩步培養(yǎng)法設(shè)計(jì)方案中,多通過(guò)離心過(guò)濾等方式來(lái)分別收獲兩個(gè)階段處理后的藻細(xì)胞, 會(huì)大幅度提高生產(chǎn)成本[7]。本文對(duì)照組F01藻細(xì)胞自絮凝率高達(dá)90%以上, 其EPS組分中疏水性的蛋白樣色氨酸含量高可能是其具有優(yōu)良自絮凝性能的生化基礎(chǔ), 兩步培養(yǎng)法不同處理組雖然通過(guò)改變EPS中蛋白類色氨酸組分的含量而影響藻細(xì)胞的絮凝率(圖 4和表 2), 但對(duì)油脂增效顯著的低糖、低氮等處理組的藻細(xì)胞自絮凝率基本在85.00%以上(表 2), 能滿足自絮凝收獲的要求, 無(wú)需增加收獲經(jīng)濟(jì)成本, 這對(duì)兩步培養(yǎng)法生產(chǎn)微藻油脂而言是極為重要。

自絮凝凱式擬小球藻F01是生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)良潛力藻種, 兩步培養(yǎng)法能大幅提升其產(chǎn)油效益。產(chǎn)油微藻的自絮凝優(yōu)勢(shì)與兩步培養(yǎng)法結(jié)合, 有望成為解決微藻生物柴油生產(chǎn)技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵突破口。