光葉眼子菜響應(yīng)夏季高溫的模擬研究

邱念偉 高 珊 周培軍 舒鳳月 侯元同 周 峰

(1. 曲阜師范大學生命科學學院, 曲阜 273165; 2. 南京曉莊學院食品科學學院, 南京 211171)

南四湖是我國第六大淡水湖(面積1266 km2),在我國南水北調(diào)、航運等方面具有十分重要的地位[1], 其中微山湖面積最大, 達660 km2。光葉眼子菜 (Co. Potamogeton lucensL.)群落在微山湖區(qū)廣泛分布, 群落面積約占微山湖面積的1/4, 群落蓋度高達85%—100%, 群落內(nèi)以多年生沉水植物光葉眼子菜為絕對優(yōu)勢種, 群落結(jié)構(gòu)單一, 僅有少量篦齒眼子菜和黑藻伴生[2]。光葉眼子菜是多年生沉水草本植物, 屬于眼子菜科(Potamogetonaceae)眼子菜屬(Potamogeton), 具有一定的觀賞價值和凈化污水的功能。光葉眼子菜夏秋兩季在湖中大量繁殖, 生物量分別為微山湖生物量的52.83%和91.27%, 湖中密布的光葉眼子菜嚴重影響了航運和漁業(yè), 秋季光葉眼子菜集中死亡, 腐敗的植物體又嚴重影響了水質(zhì)。要有效利用和治理光葉眼子菜, 必須了解其生活習性。調(diào)查發(fā)現(xiàn), 光葉眼子菜群落主要分布在2 m以上的深水區(qū), 1 m左右的淺水區(qū)分布較少, 且在夏季出現(xiàn)非自然死亡現(xiàn)象, 深水區(qū)的眼子菜在10月份才大量集中死亡。因此推測眼子菜的分布可能與夏季水溫有關(guān), 夏季高溫強光天氣時, 淺水湖區(qū)水溫可達35℃以上, 水體高溫可能是導致光葉眼子菜夏季衰老死亡的重要原因[3]。

溫度是影響植物生長的最重要的環(huán)境因子之一, 每種植物都有適合其生長發(fā)育的最適溫度, 某種沉水植物的最適溫度可能對其他物種具有高度的競爭壓力, 從而形成種群優(yōu)勢[4,5]。反之, 淺水區(qū)夏季高水溫則可能會抑制光葉眼子菜生長, 進而影響其在淺水區(qū)的分布和競爭力。前人研究發(fā)現(xiàn), 不同的沉水植物最適生長溫度和對高溫脅迫的耐受能力不同, 如黑藻具有耐高溫和低光照的能力, 在水溫高達42℃時仍能正常生長開花[6]; 金魚藻和伊樂藻在35℃以上高溫下培養(yǎng)15d以后, 兩種藻的生長都會受到抑制, 但金魚藻的耐熱性顯著好于伊樂藻[7]; 在相同高溫脅迫下, 菹草、苦草、伊樂藻的生長競爭力也有很大差異[8]。總之, 在淡水生態(tài)系統(tǒng)中, 水溫是影響大型水生植物群落中各物種分布的關(guān)鍵因素之一[9,10]。

本文人工模擬夏季短時高水溫環(huán)境, 從代謝和光合作用的角度, 分析了光葉眼子菜的耐熱性, 為探討光葉眼子菜在微山湖的分布與水溫的關(guān)系提供參考, 也為了解各類沉水植物的耐熱性積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016年7月中旬, 從南四湖的微山湖深水區(qū)(水深2 m, 水溫25℃)用打草器采集自然狀況下生長良好的光葉眼子菜(Co.Potamogeton lucensL.), 連同湖水立即帶回實驗室進行模擬高溫處理。

1.2 高溫處理

實驗以溫度作為單一因素, 設(shè)25℃、30℃、35℃和40℃四個處理溫度, 其中以25℃為對照(CK)。選取生長良好、長勢一致的光葉眼子菜置于上述4個溫度梯度的恒溫循環(huán)水浴鍋內(nèi), 鍋內(nèi)水體為天然湖水?？紤]在自然條件下, 湖水中高水溫主要在中午持續(xù)2—3h, 所以暗中高溫短時處理3h后, 立即取出光葉眼子菜, 測定生理生化指標和光合參數(shù)。暗處理是為了研究單純高溫對光葉眼子菜的傷害, 同時使葉片充分暗適應(yīng), 以便進行葉綠素熒光動力學測定。

1.3 實驗方法

葉綠素含量的測定將葉片從水中取出, 用吸水紙吸干葉片表面水分后, 稱取0.1 g。然后將葉片切成0.1 cm的細絲, 用二甲基亞砜2 mL于65℃恒溫箱暗中浸泡提取2h至葉片發(fā)白, 冷卻后用8 mL 80%丙酮稀釋葉綠素提取液并混勻, 使用紫外可見分光光度計測定其在663.6和646.6 nm處的吸光度。代入下列公式計算葉綠素總濃度(CT=7.35A663.6+17.58A646.6), 每個處理溫度測定5個重復[11]。

蛋白質(zhì)含量的測定稱取葉片0.5 g, 加入5 mL預冷蒸餾水和少量石英砂, 在冰上充分研磨后, 4℃,4000×g離心10min, 取上清液測定蛋白質(zhì)含量, 以結(jié)晶牛血清蛋白作為標準蛋白[12], 每個處理溫度測定5個重復。

可溶性糖和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量測定取光葉眼子菜葉片0.5 g, 加入5 mL 10%TCA充分研磨后, 室溫5000×g離心10min, 取上清液1 mL, 然后采用王妍等人的TBA法測定可溶性糖與MDA含量[13], 每個處理溫度測定5個重復。

葉綠素快相熒光動力學參數(shù)的測定取出高溫暗處理3h的光葉眼子菜葉片, 立即在暗處用Handy PEA (Plant Efficiency Analyser; Hansatech Instrument Ltd., UK)測定其葉綠素快相熒光動力學曲線。激發(fā)光波長為650 nm的紅光, 光強為3000 μmol/(m2.s),熒光信號的記錄時程為1s, 每個溫度處理測定10個重復。用BiolyzerHP3軟件解析并計算熒光參數(shù), 相關(guān)參數(shù)的推導、運算及生理意義參見文獻[14, 15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和繪圖, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著極差法(LSR)分析不同溫度下各生理生化參數(shù)的差異顯著性。平均數(shù)上標記相同的小寫字母表示處理間無顯著差異(P＞0.05), 標記不同小寫字母表示處理間差異顯著(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫對光葉眼子菜葉片葉綠素和蛋白質(zhì)含量的影響

在25—40℃水浴中處理光葉眼子菜3h后, 立即取出, 測定葉綠素含量, 圖 1顯示: 與對照(25℃處理)相比, 30℃處理并未影響其葉片葉綠素含量(P＞0.05); 而在35℃和40℃高溫處理后, 葉綠素含量顯著低于對照(P＜0.05), 分別比對照下降了9.8%和17.1%, 說明35℃及以上水溫對光葉眼子菜的光合系統(tǒng)有明顯傷害。在高溫處理后, 可溶性蛋白含量的變化趨勢與葉綠素類似, 在35℃和40℃高溫處理后, 可溶性蛋白含量分別比對照下降了8.3%和17.2%。蛋白質(zhì)是各類代謝活動的主要承擔者, 其含量下降會影響細胞的多種代謝活動。

2.2 高溫脅迫對光葉眼子菜葉片可溶性糖和丙二醛含量的影響

可溶性糖既是光合作用的直接產(chǎn)物, 也是植物細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在35℃和40℃高溫處理后, 光葉眼子菜的可溶性糖含量也顯著低于對照(P＜0.05), 分別比對照降低了30.5%和38.3%, 說明高溫下糖的合成受到抑制或分解加快(圖 2)。35℃和40℃高溫同時誘導了明顯的膜脂過氧化, 膜脂過氧化產(chǎn)物——丙二醛含量顯著升高(P＜0.05),分別為對照的1.29倍和2.01倍。這說明35℃高溫對光葉眼子菜來說是一種脅迫。同樣, 在30℃條件下的光葉眼子菜葉片可溶性糖和丙二醛含量與對照相比差異均不顯著(P＞0.05)。

圖 1 不同溫度處理對光葉眼子菜葉片葉綠素含量(A)和可溶性蛋白含量(B)的影響Fig. 1 Effects of different temperatures on the chlorophyll content(A) and soluble protein content (B) in P. lucens leaves

圖 2 不同溫度處理對光葉眼子菜葉片可溶性糖含量(A)和丙二醛含量(B)的影響Fig. 2 Effects of different temperatures on the soluble sugar content (A) and MDA content (B) in P. lucens leaves

2.3 高溫脅迫對光葉眼子菜葉片光合功能的影響

高溫脅迫對光葉眼子菜葉片葉綠素熒光動力學曲線的影響 光合作用是對各種逆境比較敏感的代謝活動, 光葉眼子菜屬于沉水植物, 其光合效率不宜用光合儀進行測定?？煜嗳~綠素熒光技術(shù)是探測植物光合活性的靈敏、快速、無損傷的探針, 可以系統(tǒng)地反映植物的光合結(jié)構(gòu)、過程和效率的變化[16], 能探測各類植物材料的光合性能。光葉眼子菜高溫暗處理3h后, 立即取出葉片, 用Handy PEA測定其葉綠素快相熒光動力學曲線。原始OJIP平均曲線顯示(圖 3A), 隨著處理溫度的升高,光葉眼子菜葉片的I相和P相熒光強度逐漸下降; 在40℃高溫下, J相熒光強度開始顯著低于對照, 說明高溫影響了葉片的光化學效率, 但未觀察到明顯的K峰。

為了更深入地觀察高溫逆境對光葉眼子菜的OJIP曲線的影響, 需要對原始曲線進行標準化處理。第一種標準化方法是Fm-Fo標準化, 即先將任意時刻的熒光值(Ft)標準化為“Vt”,Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)。用Vt重新繪制OJIP的時間對數(shù)曲線, 這樣Vt標準曲線的O相熒光值均變成了0, P相的熒光值均變成了1 (圖 3B左)。然后再將對照(25℃)的任意時刻Vt值設(shè)為0, 用處理與對照溫度的Vt差值(ΔVt)再重新繪制OJIP曲線(圖 3B右), 這樣就可以清楚地觀察到處理與對照熒光曲線上K相(300μs處)和J相(2ms處)的熒光變化。結(jié)果顯示, 在30℃及以上高溫下, 光葉眼子菜的ΔVt曲線上K相和J相出現(xiàn)明顯的凸起; 并且溫度越高, 凸起越高(圖 3B右)。K相凸起說明光系統(tǒng)II (Photosystem II, PSII)的放氧復合體失活; J相升高則說明電子越過質(zhì)體醌QA的效率下降[17]。30℃處理即出現(xiàn)K峰, 證明光葉眼子菜的光合系統(tǒng)對高溫比較敏感。

第二種標準化方法是Fj-Fo標準化, 方法是將任意時刻的熒光值(Ft)標準化為“Wt”,Wt=(Ft-Fo)/(Fj-Fo)。用Wt重新繪制OJIP時間對數(shù)曲線,Wt曲線上O相的熒光值均變成了0, J相的熒光值均變成了1(圖 3C左)。然后再將對照(25℃)任意時刻的Wt值全部設(shè)為0, 用處理與對照的Wt差值(ΔWt)重新繪制OJIP曲線(圖 3C右), 這樣就可以清楚地觀察處理與對照熒光曲線上O相與J相之間的熒光變化, 以及J相之后的熒光變化[17]。結(jié)果顯示, 30℃及以上高溫處理后, ΔWt曲線上仍可以觀察到明顯的K峰, 且與對照曲線相比, I相(30ms處)和P相(約300ms處)熒光顯著下降, 進一步證明高溫影響光葉眼子菜放氧復合體活性和光化學效率。

為觀察PSII反應(yīng)中心受高溫破壞的程度, 還有一種Fk-Fo標準化方式, 以觀察O相和K相之間是否出現(xiàn)L峰(150μs處), 即L-band[18]。具體方法是將50-300 μs時熒光值(Ft)標準化為“Wk”,Wk=(Ft-F50μs)/(F300μs-F50μs)。用Wk重新繪制照光后50—300 μs的熒光曲線。然后再將對照(25℃)的任意時刻Wk值全部設(shè)為0, 用處理與對照的Wk差值(ΔWk)重新繪制50-300 μs的熒光曲線(圖 4右)。如果高溫處理的ΔWk曲線上隆起L-band, 說明高溫破壞了反應(yīng)中心復合體的結(jié)構(gòu)。但圖 4結(jié)果顯示, 在30—40℃高溫處理后, 光葉眼子菜的ΔWk曲線上并未隆起L-band,說明30-40℃高溫下光葉眼子菜PSII反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)仍保持穩(wěn)定。

高溫脅迫對光葉眼子菜葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響用BiolyzerHP3軟件解析不同溫度下光葉眼子菜的葉綠素熒光動力學曲線, 可以計算出反映植物葉片光合結(jié)構(gòu)、過程、速度和效率的光合熒光參數(shù), 進一步了解光葉眼子菜在高溫下的光合特征。把對照溫度下(25℃)葉片的熒光參數(shù)均標準化為1, 用其他溫度下的熒光參數(shù)與對照參數(shù)的比值繪制成雷達圖(圖 5), 可以更清楚地觀察和比較高溫對植物光合功能的影響。結(jié)果顯示, 在35℃和40℃高溫下, 光葉眼子菜到達最大熒光(Fm)所需的時間(Tfm)顯著變短, 100和300 μs時光反應(yīng)中心的關(guān)閉速率(dVG/dto, dV/dto)也顯著變慢。隨著處理溫度的升高, I相相對可變熒光強度(Vi)變化不大, J相相對可變熒光強度(Vj)則顯著增大, 說明電子經(jīng)過質(zhì)體醌B(QB)時的電子傳遞效率(1-Vi)受高溫影響不大, 高溫主要影響了光葉眼子菜質(zhì)體醌A(QA)處的電子傳遞效率(ψo=1-Vj)。在35℃和40℃高溫下初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)均變小, 熱耗散的量子比率(Fo/Fm,φDo)顯著增大, 捕獲光能與熱耗散能量的比例(Fv/Fo)及捕獲光能用于電子傳遞的量子比率(φEo)變小, 因此PSII最大光化學效率(Fv/Fm,φPo)顯著下降。在高溫下光系統(tǒng)Ⅰ (PhotosystemⅠ, PSI)的相對活性(φRo)也有所降低, 質(zhì)體醌庫(Sm)稍有減小, 但質(zhì)體醌周轉(zhuǎn)次數(shù)(N)和還原速率(Sm/Tfm)與對照相比差異并不顯著, 說明光葉眼子菜的質(zhì)體醌庫和PSI在高溫下相對穩(wěn)定, 主要是使PSII的非光化學比例(Kn)增大。

圖 4 不同溫度處理對光葉眼子菜葉片葉綠素熒光動力學曲線L-band的影響Fig. 4 The L-band on chlorophyll a fluorescence curves of P.lucens leaves under different temperatures

從單個反應(yīng)中心活性來看, 隨著處理溫度的升高, 光葉眼子菜單個反應(yīng)中心光能的吸收(ABS/RC)和捕獲(TRo/RC)是增大的, 但捕獲光能用于電子傳遞的效率(ETo/RC)降低, 從而使反應(yīng)中心捕獲的光能更多地以熱能散失, 熱耗散(DIo/RC)增大。從單位面積光合活性來看, 因為高溫下葉片單位激發(fā)態(tài)面積的反應(yīng)中心數(shù)目(RC/CSo)減少, 所以單位面積光能的捕獲(TRo/CSo)和電子傳遞效率(ETo/CSo)均降低, 單位面積熱能耗散(DIo/CSo)依然增大, 而單位面積光能的吸收(Fo=ABS/CSo)維持相對穩(wěn)定, 直到40℃高溫下才顯著低于對照。光葉眼子菜的光合作用綜合性能指數(shù)對高溫更為敏感, 隨著處理溫度的升高, 葉片的結(jié)構(gòu)功能指數(shù)(Structure and function index of plants,SFI)、性能指數(shù)(Performance index of plants,PI(abs))和光合驅(qū)動力(Drive force for photosynthesis,DF)均呈明顯下降趨勢。

3 討論

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一, 在炎熱的夏季陽光照射下, 淺水區(qū)水溫可達35℃以上, 光葉眼子菜在南四湖淺水區(qū)分布較少,很可能與其耐熱性有關(guān)。本文生理生化結(jié)果顯示,在35℃和40℃高溫下, 光葉眼子菜葉片的葉綠素、蛋白質(zhì)和可溶性糖含量開始顯著低于對照, 丙二醛含量開始高于對照; 而30℃時上述指標與對照相比差異不顯著, 說明當溫度高于35℃對光葉眼子菜即是一種高溫脅迫(圖 1、圖 2)。夏季在微山湖淺水區(qū)觀察到光葉眼子菜有衰老死亡現(xiàn)象, 其衰老死亡也可能是由于光合系統(tǒng)被高溫破壞的緣故。陸生植物的耐熱性研究證明高溫誘導植物葉片衰老死亡是由于高溫破壞葉綠體結(jié)構(gòu), 影響葉綠體電子傳遞效率, 造成葉綠體光合電子傳遞鏈滲漏電子, 產(chǎn)生活性氧, 從而誘導細胞凋亡[19,20]。前人主要從生長和抗氧化的角度探測了高溫對沉水植物的影響[6—10]。因為光合作用是對高溫等逆境最為敏感的化學過程[21], 所以本文以葉綠素熒光技術(shù)為探針,分析了高溫下光葉眼子菜葉片光合結(jié)構(gòu)和功能的變化。

葉綠素熒光誘導動力學曲線上出現(xiàn)K峰是高溫傷害PSII的標志性特征[21], 大部分植物在45℃高溫脅迫下都會出現(xiàn)明顯的K峰, 如大麥用40℃處理10min, OJIP原始曲線上并未觀察到明顯的K峰, 而用45℃處理10min就會出現(xiàn)顯著的K峰[22]。光葉眼子菜經(jīng)30—40℃高溫處理后的原始熒光曲線上并未觀察到明顯隆起的K相, 只有經(jīng)過Fm-Fo標準化后才能觀察到K峰(圖 3B、圖 3C);Fk-Fo標準化曲線上也未發(fā)現(xiàn)明顯的L-band (圖 4), 說明35℃和40℃對光葉眼子菜葉片的傷害并不是特別嚴重[17],主要是影響了反應(yīng)中心放氧復合體和反應(yīng)中心的活性, 并未導致大量放氧復合體或者反應(yīng)中心失活。中等熱脅迫下一般不會導致放氧復合體解離和反應(yīng)中心失活[23], 只有重度熱脅迫才會使放氧復合體從PSII解離, 導致Mn簇從反應(yīng)中心復合體釋放出來, 最終使放氧復合體完全失活[24]。

圖 5 不同溫度處理的光葉眼子菜葉片葉綠素參數(shù)比較雷達圖Fig. 5 The radar diagram of fluorescence data of P. lucens leaves under different temperatures

熒光參數(shù)還可反映高溫脅迫對植物光反應(yīng)過程和效率的影響[25], 高溫脅迫對光葉眼子菜葉片光合功能的影響主要表現(xiàn)為熱耗散(Fo/Fm、φDo、DIo/RC、DIo/CSo)增加, 單位激發(fā)態(tài)面積的光能捕獲效率(TRo/CSo)和電子傳遞效率(ETo/CSo)顯著下降, 這種光合功能的下降與單位面積有活性的反應(yīng)中心數(shù)目(RC/CSo)減小有關(guān)(圖 5)。ΔWk曲線上未隆起L-band, 說明光葉眼子菜反應(yīng)中心未受到顯著破壞, 但其150和300μs時的反應(yīng)中心關(guān)閉速率(dVG/dto、dV/dto)變慢, 可能是因為放氧復合體活性降低, 電子供應(yīng)不足所致[23]。單個反應(yīng)中心的電子傳遞效率(ETo/RC、φEo)也是下降的, 說明高溫影響了光葉眼子菜PSⅡ反應(yīng)中心受體側(cè)的電子傳遞活性。此外, 在高溫脅迫下, 光葉眼子菜的質(zhì)體醌庫(Sm)也顯著變小, 也會導致PSⅡ電子傳遞效率下降, 這些現(xiàn)象與甜高粱等農(nóng)作物的熱傷害效應(yīng)類似[26]。因此高溫對光葉眼子菜光系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和活性都具有顯著影響。但35℃和40℃高溫脅迫對光葉眼子菜光系統(tǒng)的傷害并不嚴重, 并未導致光葉眼子菜衰亡。一般單純高溫脅迫往往45℃以上才會對植物的光系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重傷害, 這與離體實驗效果類似[27]。微山湖淺水區(qū)夏季卻出現(xiàn)光葉眼子菜衰老死亡現(xiàn)象, 主要是因為夏季中午高溫往往伴隨著強光, 強光與高溫脅迫同時存在會加重對植物的傷害, 如35℃亞高溫和1000 μmol/(m2.s)光強組合處理即可對番茄幼苗造成嚴重傷害[28]。

在高溫脅迫下, 質(zhì)體醌庫減小, 會導致電子傳遞受阻, 在光合電子傳遞鏈上產(chǎn)生電子滲漏, 生成活性氧, 活性氧的含量與高溫脅迫溫度呈正相關(guān)[8]。對于植物的綠色組織而言, 在逆境條件下90%以上的活性氧來自葉綠體[29], 活性氧水平升高可誘導膜脂過氧化。本文結(jié)果顯示在35℃和40℃高溫脅迫下丙二醛含量分別為對照的1.29倍和2.01倍, 說明高溫對光葉眼子菜產(chǎn)生了明顯的過氧化傷害。在高溫下維持葉綠體的活性對植物的耐熱性至關(guān)重要, 植物在可耐受的高溫條件下會主動合成熱激蛋白等保護性物質(zhì)提高抗熱性, 這時蛋白質(zhì)含量與溫度呈正相關(guān)[30]。本文的結(jié)果卻相反, 在35℃和40℃高溫脅迫下, 光葉眼子菜的蛋白質(zhì)含量顯著低于對照, 推測可能是在高溫下光葉眼子菜蛋白質(zhì)分解加快或合成受阻, 不能有效快速合成熱激蛋白增強耐熱性。還有很多植物在高溫脅迫下合成大量滲透保護物質(zhì)來提高抗熱性[31], 可溶性糖既是光合產(chǎn)物,也是最常見的滲透保護物質(zhì)。在35℃和40℃高溫脅迫下, 光葉眼子菜的可溶性糖含量也顯著低于對照。上述結(jié)果說明光葉眼子菜缺乏有效的耐熱機制。

綜上所述, 光葉眼子菜在35℃及以上單純高溫脅迫下, 其光合活性即受到顯著抑制, 出現(xiàn)明顯的熱脅迫損傷, 證明其是一種熱敏感的沉水植物。光葉眼子菜作為南四湖最主要的優(yōu)勢物種, 主要分布在深水區(qū), 可能與其熱敏感有關(guān), 夏季淺水區(qū)的高水溫可導致其衰亡, 影響了其在淺水區(qū)的競爭力。