體重波動(dòng)對(duì)小鼠血糖水平的影響

宗艾倫，周迎生

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，北京市心肺血管疾病研究所 北京 100029)

肥胖導(dǎo)致血糖升高和糖尿病，限食(diet restriction)減重能延緩和降低2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展[1-4]。既往研究表明，肥胖者限食減重5%以上可顯著改善血糖水平和胰島素敏感性[5]，減重超過(guò)10%且維持1年以上才能使身體真正獲益，而30%～60%減重者不能堅(jiān)持1年[3]。體重波動(dòng)(weight cycling)現(xiàn)象在肥胖減重過(guò)程中容易發(fā)生，即限食減重止于高熱量飲食增重，不斷重現(xiàn)，稱(chēng)為溜溜球瘦身(Yo-yo dieting)[6]。關(guān)于體重波動(dòng)對(duì)糖代謝和肥胖影響的報(bào)道有差異，多數(shù)認(rèn)為對(duì)糖尿病發(fā)病和體內(nèi)脂肪分布沒(méi)有影響[6-8]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)高熱量飲食導(dǎo)致肥胖和葡萄糖代謝異常[9]，限食減重能夠逆轉(zhuǎn)代謝異常[10]。 體重波動(dòng)的基本形式為肥胖減重后高熱量飲食增重，體重、糖代謝及胰島素敏感性如何變化對(duì)肥胖和糖尿病防控機(jī)制研究有實(shí)踐意義。 本研究擬通過(guò)飲食干預(yù)小鼠體重探索體重波動(dòng)響血糖水平變化的規(guī)律特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF/VAF級(jí)C57BL/6小鼠為8周齡，雄性，54只，體重22～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2016-0011】，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心肺血管疾病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部【SYXK(京) 2016-0027】完成小鼠飼養(yǎng)及部分相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。動(dòng)物正常飲食、進(jìn)水，飼養(yǎng)環(huán)境安靜、舒適，12/12 h晝夜規(guī)律，飼養(yǎng)溫度恒定在22～26℃，空氣濕度維持在60%～70%。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：AEEI-2017-107)。

1.1.2 試劑與儀器

戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))，10%中性福爾馬林固定液(北京化工廠)，蘇木素、伊紅(北京中杉金橋公司)，環(huán)保型透明脫蠟液(無(wú)錫市江原公司)，無(wú)水乙醇、濃鹽酸、冰醋酸(北京化工廠)，中性樹(shù)膠(北京索萊寶公司)，25%葡萄糖注射液(中國(guó)大冢制藥有限公司)，生物合成人胰島素(Eli Lilly公司，美國(guó))，0.9%氯化鈉溶液(北京華潤(rùn)雙鶴公司)；電子天平(AL204，Mettler Toledo公司，瑞士)，全自動(dòng)組織脫水機(jī)(TP1020，Leica公司，德國(guó))，石蠟包埋機(jī)(EG1150 H，Leica公司，德國(guó))，石蠟切片機(jī)(RM2235，Leica公司，德國(guó))，烤箱(GZX-9023 MBE，上海博訊公司)，顯微鏡(ECLIPSE 80i/90i，Nikon公司，日本)，血糖儀(ContourTMTS，Bayer公司，德國(guó))，4℃/-20℃/-80℃冰箱(中國(guó)海爾集團(tuán)公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分三組，每組18只；(1)對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)；(2)肥胖組，高熱量飼料喂養(yǎng)；(3)干預(yù)組，高熱量飼料—60%普通飼料—高熱量飼料交替喂養(yǎng)。

1.2.2 體重波動(dòng)模型建立

參考前期研究建立飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型[10-11]。高熱量飼料(D12492, Research Diets公司，美國(guó))為蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪熱占比20%、20%、60%，喂養(yǎng)8周(體重達(dá)到穩(wěn)定，即三次體重結(jié)果間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)后呈肥胖模型(體重>35%對(duì)照組[10,12])，隨機(jī)分入體重干預(yù)組(intervention group, IT,n=18)和肥胖組(obesity group, OB,n=18)。對(duì)照組(control group，CON)則為普通飼料(蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪熱占比20%、70%、10%)喂養(yǎng)。體重干預(yù)方式為給予60%對(duì)照組食量【干預(yù)組食量=正常對(duì)照組每日攝食量(前3 d平均值)×60%】的普通飼料喂養(yǎng)4周，使其體重下降至同CON組的差異無(wú)顯著性(P>0.05)，此后即恢復(fù)高熱量飼料喂養(yǎng)3周，直至體重恢復(fù)增長(zhǎng)到與OB組體重的差異無(wú)顯著性(P>0.05)時(shí)為止。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，每周定時(shí)禁食12 h稱(chēng)重一次，并用血糖儀(ContourTMTS，Bayer公司，德國(guó))采鼠尾靜脈血測(cè)定空腹血糖一次。以相鄰兩周間體重變化量計(jì)算體重增長(zhǎng)率，以相鄰兩周間空腹血糖變化量計(jì)算空腹血糖增長(zhǎng)率。體重增速計(jì)算按體重變化量/變化對(duì)應(yīng)時(shí)間(周)，血糖增速計(jì)算按血糖變化量/變化對(duì)應(yīng)時(shí)間(周)。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)

參考前期研究建立方法[13]行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)。在干預(yù)終點(diǎn)時(shí)，小鼠禁食不禁飲水16 h，鼠尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖。小鼠腹腔注射25%葡萄糖溶液給予糖負(fù)荷(2 g/kg)。血糖儀(ContourTMTS，Bayer公司, 德國(guó))測(cè)定糖負(fù)荷后 15、30、60、120 min各點(diǎn)血糖，繪制血糖變化曲線，計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 胰島素耐受試驗(yàn)(ITT)

按既往研究方法胰島素敏感性由胰島素耐受試驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)反映，即小鼠禁食不禁飲6 h后，按體重腹腔注射人短效胰島素(0.75 mU/g，Eli Lilly，美國(guó))，分別測(cè)定注射前、注射后 15、30、60 及 120 min 血糖水平，繪制血糖變化曲線，計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 體內(nèi)脂肪及代謝參數(shù)測(cè)定

目前，ISO／IEC17025：2005［11］以及 GB／T 27025－2008［12］中均要求檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具有評(píng)價(jià)測(cè)量不確定度的程序，能夠?qū)z測(cè)項(xiàng)目的不確定度作出正確評(píng)估，滿足客戶及檢測(cè)工作的要求。測(cè)量不確定度在實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比對(duì)、方法確認(rèn)、標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備校準(zhǔn)、量值溯源以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與管理等方面具有重要的意義。本研究根據(jù) JJF1059.1－2012［13］、CNAL ／AG06：2003［14］技術(shù)規(guī)范的要求，對(duì)HPLC-ICP-MS技術(shù)測(cè)定牛黃解毒片中砷元素形態(tài)的不確定度進(jìn)行了分析，以期為這方面研究提供參考。

小鼠禁食過(guò)夜，腹腔注射1% 戊巴比妥鈉麻醉(80 mg/kg)。麻醉后充分伸展，測(cè)量體長(zhǎng)、體重和腹圍等基礎(chǔ)信息。內(nèi)臟脂肪測(cè)定，參考文獻(xiàn)[14]，完整剪取雙側(cè)附睪脂肪、雙側(cè)腎周脂肪及重要器官組織，迅速稱(chēng)量濕重。內(nèi)臟脂肪比例按(雙側(cè)腎周脂肪質(zhì)量+雙側(cè)附睪脂肪質(zhì)量)/體重計(jì)算。

1.2.6 胰腺HE染色

腹腔注射1% 戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，獲取胰腺組織，甲醛固定24 h，脫水后石蠟包埋(EG1150 H，Leica公司，德國(guó))。包埋時(shí)使得組織切面向下并沉至石蠟底部，以便切取完整截面。石蠟切片制備：將包埋盒凍存在-20℃冰箱內(nèi)，切片前取出放置在冰上，切片厚度參考文獻(xiàn)[15]，6 μm，調(diào)整切片刀口位置，盡量切取完整組織。切片室溫下30%乙醇中展片時(shí)間 2～3 min后，42℃溫水展片5～10 s。貼片時(shí)在80℃烤箱內(nèi)烤100 min，以防止組織后續(xù)染色中脫落。此后，石蠟切片脫蠟、蘇木素染色30 s、分化、伊紅染色10 s，透明1 h后中性樹(shù)膠封片觀察。顯微鏡400倍視野下拍照。每組6只小鼠，每只小鼠隨機(jī)選取10張切片(每張切片至少間隔200 μm，避免重復(fù)測(cè)量相同胰島)。選擇隨機(jī)切片中所有胰島，應(yīng)用 Image J 圖像分析軟件測(cè)算胰島照片面積。手工圈定胰島在照片中輪廓，軟件measure功能自動(dòng)統(tǒng)計(jì)圈定面積中像素單位數(shù)量，使用像素單位代替胰島面積，至少重復(fù)3次，取平均數(shù)。計(jì)算胰島面積均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，分析比較三組間胰島面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較為單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗(yàn)分析。應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高熱量飼料喂養(yǎng)的小鼠體重增長(zhǎng)率較對(duì)照組顯著增加

8周齡C57BL/6小鼠經(jīng)高熱量飼料喂養(yǎng)2周起，體重超過(guò)CON組(24.8±2.7 g vs 21.5±1.7 g，P<0.05)，至第8周時(shí)肥胖(體重>正常對(duì)照35%)，超出CON組44%(36.3±2.3 g vs 25.3±1.9 g，P<0.001)，體重增長(zhǎng)率為對(duì)照組的1.62倍(6.3%±3.2% vs 3.9%±1.2%，P<0.05)，如圖1 A、B所示。能量攝入較對(duì)照組增加了23.9%(68.3±2.1 vs 52.0±1.7 KJ/d,P<0.001)。

2.2 肥胖小鼠限食干預(yù)減重顯著，恢復(fù)高熱量飼料喂養(yǎng)則體重增長(zhǎng)更快

2.3 體重波動(dòng)對(duì)糖代謝和胰島素敏感性的影響

體重和空腹血糖水平均在高熱量飼料喂養(yǎng)2周后超過(guò)CON組(P<0.05)，升高到第8周達(dá)到穩(wěn)態(tài)，空腹血糖平均增長(zhǎng)率顯著高于CON組(15.2%±4.0% vs 1.7%±1.0%，P<0.05)(如圖1C、D所示)，是同期體重增速的2.41倍。限食干預(yù)后第1周，IT組體重和空腹血糖下降，與OB組差異有顯著性(P<0.05)，但體重平均降幅顯著低于血糖變化(33.4% vs 113.1%，P<0.05)。第2次高熱量飼料喂養(yǎng)時(shí)，空腹血糖增速是第1次喂養(yǎng)的5.13倍，高于體重2.27倍。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，IT組IPGTT血糖曲線下面積較OB組顯著增加12.8%(P<0.05)，表現(xiàn)為葡萄糖耐量受損，如圖2 A、B所示。ITT血糖曲線下面積較OB組顯著升高(P<0.01)，為胰島素敏感性降低，差異有顯著性(P<0.05)，如圖2C、D所示。

2.4 體脂和胰島面積改變

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)IT組內(nèi)臟脂肪比例、腎周脂肪、附睪脂肪和肝質(zhì)量均較OB組升高，差異有顯著性(P<0.05)，但空腹血糖、體重、胰腺重量與OB組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，如表1所示。 IT組胰島面積較OB組顯著縮小(P<0.05)，但同CON組的差異無(wú)顯著性(P>0.05)，如圖3所示。

注：A. 小鼠體重變化；B. 體重變化百分比； C. 小鼠空腹血糖變化； D. 空腹血糖變化百分比。圖1 飲食影響小鼠體重及空腹血糖變化Note. A. Change of body weight in mice. B. Percent change in body weight. C. Change of fasting blood glucose in mice. D. Percentage change in fasting blood glucose.Figure 1 Diet affects body weight and fasting blood glucose changes in mice

注：A、B. IPGTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、肥胖組及干預(yù)組血糖水平及血糖曲線下面積。C、D. ITT實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、肥胖組及干預(yù)組血糖水平及血糖曲線下面積。圖2 體重波動(dòng)對(duì)葡萄糖耐量和胰島素敏感性的影響Note. A, B. IPGTT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve in the control group, obesity group, and intervention group. C, D. ITT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve in the control group, obesity group, and intervention group.Figure 2 Effect of body weight fluctuation on glucose tolerance and insulin sensitivity

分組Groups體重(g)Body weight(g)空腹血糖 (mmol/L)Fasting blood glucose (mmol/L)腎周脂肪(mg)Perirenal fat weight(mg)附睪脂肪(mg)Epididymal fat weight(mg)對(duì)照組Control group29.9±1.45.0±0.7154.8±53.2355.7±44.3干預(yù)組Intervention group49.5±1.7***8.6±0.6***730.8±105.6***#2800.0±149.1***##肥胖組Obesity group49.3±1.9***9.1±0.4***514.9±197.9***2399.8±343.8***分組Groups內(nèi)臟脂肪比例(%)Visceral fat weight/Body weight(%)胰腺質(zhì)量(mg)Pancreas weight(mg)肝質(zhì)量(mg)Liver weight(mg)腹圍(cm)Abdominal circumference(cm)對(duì)照組Control group1.7±0.3181.8±24.21140.7±67.17.3±0.3干預(yù)組Intervention group7.1±0.3*** ##331.7±45.2***2065.2±243.7*** #10.9±1.5***#肥胖組Obesity group5.9±1.0***345.7±76.0***1708.0±422.4**9.7±0.6**

注：與對(duì)照組CON比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。與肥胖組 OB 比較，#P< 0.05,##P< 0.01,###P<0.001。

Note.Compared with the control group(CON),*P<0.05,**P<0.01,***P< 0.001. Compared with the obesity group (OB),#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.

注：A. 三組胰島面積比較。B. 對(duì)照組胰島大小正常，形態(tài)規(guī)則，外分泌腺結(jié)構(gòu)完整。C. 干預(yù)組胰島較持續(xù)肥胖組顯著減小，形態(tài)欠規(guī)則，外面分腺結(jié)構(gòu)完整性差。D. 肥胖組胰島大小較正常對(duì)照組顯著增大，形態(tài)尚規(guī)則，外分泌腺結(jié)構(gòu)完整。圖3 小鼠胰腺病理(HE染色，×400)Note. A. Comparison of the three groups of islets. B. The islets of the control group were normal in size, regular in morphology, and the exocrine glands were intact. C. The islets of the intervention group were significantly reduced compared with those in the obesity group, the shape was not regular, and the structural integrity of the outer gland was poor. D. The islet size of the obesity group was significantly increased compared with that in the control group, the shape was regular, and the exocrine gland structure was intact.Figure 3 Pathology of the mouse pancreas(HE staining,×400)

3 討論

本研究初始階段為高熱量飼料喂養(yǎng)肥胖，小鼠體重增長(zhǎng)率低于其空腹血糖增長(zhǎng)，其變化也晚于血糖，血糖水平的變化相比體重變化更快且敏感，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]；Magkos等[5]研究也表明體重變化5%即可顯著改善血糖等代謝指標(biāo)。血糖變化早于體重變化出現(xiàn)，且變化幅度更大。在此后的限食減重階段，體重和血糖均相伴降低，分別減少35%和46%，血糖降幅更大但血糖值仍在正常低限3.9 mmol/L以上。而人肥胖減重干預(yù)使體重和血糖降低幅度相近[5]，這可能與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中可以準(zhǔn)確控制限食量有關(guān)。因此，血糖升高變化要優(yōu)于體重改變，更適合反映體重增長(zhǎng)趨勢(shì)。在本研究最后階段是停止限食恢復(fù)高熱量飼料飼養(yǎng)，小鼠體重及空腹血糖增長(zhǎng)率均比第一階段更快，體重為第一階段的2.3倍，空腹血糖為5.1倍。因此，在減重終止后，體重和血糖均有較快增長(zhǎng)且變化幅度大，必須要增加監(jiān)測(cè)的頻率才能更有效反映代謝指標(biāo)變化。國(guó)外學(xué)者也有相似的報(bào)道，認(rèn)為減重后高熱量飼料喂養(yǎng)加速體重和脂肪量增速達(dá)1.6倍，這與攝食量增加和腸道細(xì)菌環(huán)境改變有關(guān)[7, 16～18]。

本研究中體重波動(dòng)的肥胖小鼠(IT)腹腔內(nèi)脂肪量與肥胖對(duì)照組(OB)相比顯著增加，胰島素敏感性下降，胰島面積顯著縮小，糖耐量受損更加嚴(yán)重。腹腔內(nèi)脂肪量增加使胰島素敏感性下降，進(jìn)而影響葡萄糖代謝，血糖水平顯著升高[16]。有研究顯示體重波動(dòng)可顯著增加內(nèi)臟脂肪含量，使脂肪分布更偏向中心型肥胖，肝脂肪沉積加重[8]。因體重波動(dòng)可以顯著增加內(nèi)臟脂肪量，對(duì)胰島素敏感性和葡萄糖代謝影響較大，內(nèi)臟性肥胖及代謝異常應(yīng)該受到更多關(guān)注。

關(guān)于體重波動(dòng)對(duì)血糖及糖尿病發(fā)病的影響是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，目前體重波動(dòng)對(duì)于糖尿病發(fā)病是否有不良影響報(bào)道不同[16-20]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件下通過(guò)高熱量、低熱量攝食干預(yù)誘導(dǎo)小鼠體重波動(dòng)，提出體重波動(dòng)導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪量增加、胰島素敏感性降低、葡萄糖耐量受損的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將為肥胖治療和糖尿病防控提供理論依據(jù)。