葡萄糖代謝異常導(dǎo)致SIVmac239感染北平頂猴急性期體重變化

張瀚丹，宋天章，楊柳萌，鄭永唐*

(1. 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000； 2. 中國科學(xué)院昆明動物研究所、云南省活性多肽研究與利用重點實驗室/中國科學(xué)院動物模型與人類疾病重點實驗室，國家昆明高等級生物安全靈長類動物實驗中心，昆明 650223)

人類免疫缺陷綜合征(acquirid immunodeficiency syndrome，AIDS)，簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的一種嚴(yán)重致死性傳染病。目前，全球年均HIV新發(fā)感染者可達(dá)210萬人，且每年約有110萬人死于艾滋病引起的各種相關(guān)性疾病。根據(jù)艾滋病患者的臨床表現(xiàn)，可將整個病程分為3個時期：(1)急性感染期：通常出現(xiàn)在HIV初次感染后2～4周，患者常無特異性臨床表現(xiàn)，可表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、腹瀉、皮疹等癥狀；(2)無癥狀期：無明顯臨床表現(xiàn)，部分患者出現(xiàn)腹股溝等部位淋巴結(jié)腫大等癥狀，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)可使患者長期停留于無癥狀期，從而有效延長艾滋病患者壽命；(3)艾滋病期：患者表現(xiàn)出典型的艾滋病相關(guān)消瘦綜合征，并且出現(xiàn)多種機(jī)會性感染及腫瘤，最終死亡。艾滋病患者體重下降是艾滋病疾病進(jìn)展的重要表現(xiàn)，是艾滋病期的典型特征，與艾滋病患者的預(yù)后及死亡率變化密切相關(guān)。趙曉梅等[1]對HIV感染者的流行病學(xué)研究中顯示，HIV感染者的體重既有減低，也有升高。急性感染期HIV感染引起的體重變化及相關(guān)機(jī)制依然不明確且鮮見研究報道。

持續(xù)炎癥反應(yīng)、脂類代謝異常及葡萄糖代謝異常是誘發(fā)體重變化的3大主要原因。首先，以TNF-α、IL-6為主的多種促炎細(xì)胞因子的持續(xù)存在，通過多種機(jī)制影響體重變化。TNF-α可以通過旁分泌或自分泌的方式作用于脂肪細(xì)胞，抑制脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，繼而促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡及分解[2]，減少機(jī)體脂肪蓄積。Hotamisligil等[3]研究發(fā)現(xiàn)：肥胖患者多伴有IL-6等多種促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的全身持續(xù)性低度炎癥反應(yīng)；Mohamed等[4]研究表明，脂肪組織分泌大量的IL-6，其含量與肥胖程度呈正相關(guān)。脂代謝異常是誘導(dǎo)體重變化的另一重要因素。脂代謝異常常見于肥胖患者，主要表現(xiàn)為血液中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-CH)和甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-CH)降低[5]。高蛋白、高脂肪、高能量的“三高”飲食的過量攝入，會引起高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥以及低密度脂蛋白膽固醇升高，加速體重增加[6]。隨著肥胖程度的增加，血脂異常率也逐步遞增[7]，大量的內(nèi)臟脂肪堆積產(chǎn)生脂解作用，使游離脂肪酸釋放增多或脂蛋白脂肪酶的活性改變，導(dǎo)致TG、TC及LDL-CH合成增加[8]。因此，TG等的升高可作為體重增加的預(yù)測因素。第三，以糖尿病患者為代表的糖代謝異常表現(xiàn)對體重變化的誘導(dǎo)也具有重要影響。胰島素抵抗現(xiàn)象導(dǎo)致血糖無法被有效利用，從而引起體重下降。同時，為了維持血糖的穩(wěn)定，II型糖尿病患者可代償性的分泌大量胰島素，過多的胰島素從血漿轉(zhuǎn)運(yùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作為調(diào)節(jié)肥胖的負(fù)反饋信號，減少食物攝取并使體重減輕[9]。

本實驗室首先建立了艾滋病北平頂猴實驗動物模型[10]，在SIVmac239感染后可有效地模擬人HIV感染相關(guān)的臨床表現(xiàn)，模型感染急性期病毒載量及CD4+T細(xì)胞數(shù)量變化與HIV感染者急性期變化基本一致。因此，本實驗選用SIVmac239感染的北平頂猴為研究對象，探討急性期體重變化的原因及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性北平頂猴購于中國科學(xué)院昆明動物研究所靈長類研究中心【SCXK(滇)K2017-0003】。實驗動物飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明動物研究所靈長類研究中心【SYXK(滇)K2017-0008】，單獸籠飼養(yǎng)，保證標(biāo)準(zhǔn)光照周期(12 h光明，12 h黑暗)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及蘋果等瓜果類喂養(yǎng)。根據(jù)北平頂猴感染后17周內(nèi)體重變化，分別挑選出3只體重變化最明顯的北平頂猴作為體重增加組與體重減少組。本研究中所涉及的一切實驗規(guī)程均獲得中國科學(xué)院昆明動物研究所倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2015SYDW-2015021)。

1.1.2 實驗儀器

ELX-800酶標(biāo)儀(BioTek，美國)；37℃恒溫箱(上海齊欣，中國)；Cobas 8000全自動生化免疫分析儀(Roche，瑞士)；定量PCR儀(ABI ViiATM7 Real-Time PCR System, 美國)；超低溫冰箱(Haire, 中國)。

1.1.3 實驗試劑

鹽酸氯胺酮注射液(江蘇中牧)；氯化鈉注射液(昆明南疆)；猴IL-6、TNF-α、胰島素ELISA檢測試劑盒(江蘇雨桐，F(xiàn)4483B、F4490B、F6249A)；Diethylpyrocarbonate(AMRESCO，E174)；High Pure Viral RNA Kit(Roche, 11858882001)；RNA-directTMRealtime PCR Master Mix(toyobo, QRT101)。

1.2 方法

1.2.1 SIVmac239病毒接種

0.2 mL/kg鹽酸氯胺酮注射液肌肉注射麻醉，待動物徹底麻醉后，0.9%氯化鈉注射液將病毒稀釋為2000 TCID50/mL，下肢脛后靜脈接種2 mL。

1.2.2 動物血漿分離及體重稱量

北平頂猴夜間禁食，12 h后于次日清晨采血。0.2 mL/kg鹽酸氯胺酮注射液肌肉注射麻醉，待動物徹底麻醉后，進(jìn)行體重稱量，下肢脛后靜脈抽取靜脈血至含EDTAK2的真空管，1500 r/min離心15 min，吸取上層血漿，分裝后于-80℃凍存。抽血后2 h內(nèi)完成血漿分離及樣品凍存。

1.2.3 ELISA方法檢測IL-6、TNF-α、胰島素

分別采用猴IL-6、TNF-α、胰島素ELISA 檢測試劑盒測定血漿中IL-6、TNF-α、胰島素含量。按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀于波長450 nm 處檢測樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的IL-6、TNF-α及胰島素濃度。

1.2.4 血脂四項、血糖檢測及胰島素抵抗

采用Cobas 8000全自動生化免疫分析儀檢測血漿總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和血糖。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)是目前使用最廣泛的用于評價胰島素敏感性、胰島素抵抗水平的指標(biāo)，用于評價感染前后北平頂猴胰島素抵抗水平。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5。

1.2.5 Real-time PCR檢測血漿中病毒載量

按High Pure Viral RNA Kit中的實驗步驟提取血漿中總RNA：向1.5 mL RNase free Eppendorf管中加入400 μL binding buffer，2 μL poly (A) carrier RNA，再加入200 μL血漿，震蕩混勻，室溫下保持10 min；轉(zhuǎn)移到過濾柱內(nèi)，9342 r/min離心20 s；棄去收集管及其中的液體，換上新收集管，加入500 μL inhibitor removal buffer, 9342 r/min 離心1 min；棄去收集管及其中的液體，換上新收集管，加入450 μL洗滌緩沖液，9342 r/min 離心1 min，重復(fù)1次；棄去收集管，將過濾柱放到新收集管，11 908 r/min 離心10 s；棄去收集管，換上1.5 mL RNase free Eppendorf管，開口在生物安全柜放置10 min；加入50 μL Elution Buffer，9342 r/min 離心1 min，得到RNA。利用RNA-directTMRealtime PCR Master Mix進(jìn)行Real-time PCR。SIV引物參照本實驗室以往研究[11]，引物序列為：5′-TCGGTCTTAGCTCCATT AGTGCC-3′ (上游)， 5′-GCTTCCTCAGTGTG TTTCACTTTC-3′ (下游)和5′-CTTCTGCGTG AATGCACCAGATGACGC-3′ (探針)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。利用美國ABI公司ViiATM7實時熒光定量PCR儀完成檢測，反應(yīng)條件為：90℃，30 s；61℃，21 min；95℃，30 s；95℃，15 s，60℃，1 min，進(jìn)行 45個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.02軟件處理，組間比較采用t檢驗，P< 0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，運(yùn)用Pearson分析進(jìn)行線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 北平頂猴體重變化及分組

納入實驗的北平頂猴基本信息如表1。12只北平頂猴均為雄性，年齡8～10歲，感染前進(jìn)行3個月的適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間無明顯體重變化。部分實驗動物偶爾出現(xiàn)腹瀉癥狀，但是對于實驗動物體重，進(jìn)食等并無影響。根據(jù)實驗動物個體感染前體重，進(jìn)行感染后體重變化比率的分析。如圖1所示，感染第17周體重變化大于4%的個體分別納入體重增加組(weight increase group)和體重減少組(weight decrease group)。體重增加組北平頂猴編號為：08267、08327、09219；體重減少組北平頂猴編號為：08275、09221、09239。

表1 雄性北平頂猴信息Table 1 Information on the male northern pig-tailed macaques

圖1 體重增加組及體重減少組北平頂猴SIVmac239感染急性期體重變化Figure 1 Weight changes in the weight increase group and the weight decrease group in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

圖2 SIVmac239感染北平頂猴急性期血漿TNF-α (A)和IL-6 (B)變化Figure 2 Changes of plasma TNF-α (A) and IL-6 (B) in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.2 血漿IL-6和TNF-α變化

血漿IL-6和TNF-α是評價急性全身性炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，也是引起脂肪代謝變化繼而引起體重變化的關(guān)鍵因子。如圖2所示，SIVmac239感染前后，兩組實驗動物IL-6及TNF-α水平基本保持一致。血漿TNF-α感染后似乎有上升趨勢，但并無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，體重增加組與體重減少組相比，血漿IL-6及TNF-α水平在各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 血漿TC、TG、HDL-CH和LDL-CH變化

血脂四項是評價機(jī)體脂類代謝的重要指標(biāo)。如圖3所示，SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組實驗動物血漿TC、TG、HDL-CH和LDL-CH均未出現(xiàn)明顯變化。兩組相比，血漿TC、TG、HDL-CH、LDL-CH也無明顯差異。但是，感染前體重減少組LDL-CH水平明顯低于體重增加組，具體原因尚不明確。

注：A. 膽固醇；B. 三酰甘油；C. 低密度脂蛋白膽固醇；D. 高密度脂蛋白膽固醇。圖3 SIVmac239感染北平頂猴急性期的血漿血脂變化Note. A. cholesterol; B. triglyceride; C. low-density-lipoprotein cholesterol; D. high-density-lipoprotein cholesterol.Figure 3 Changes of plasma lipid level in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

注：A. 胰島素濃度變化；B. 胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)變化。圖4 SIVmac239感染北平頂猴急性期的葡萄糖代謝變化Note. A. Changes of insulin concentration; B. Changes of insulin resistance index (HOMA-IR).Figure 4 Changes of glucose metabolism in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.4 葡萄糖代謝變化

與感染前相比，SIVmac239感染后，體重增加組及體重減少組均出現(xiàn)明顯的血漿胰島素水平變化。體重減少組感染后第1.5、5及11周血漿胰島素水平明顯升高，第17周血漿胰島素水平恢復(fù)正常(圖4A)。與之相比，體重增加組感染后血漿胰島素水平明顯下降。通過HOMA-IR指數(shù)分析顯示(圖4B)，體重減少組在感染后第1.5、5及11周胰島素抵抗指數(shù)明顯增加，感染后體重增加組胰島素抵抗指數(shù)無明顯增加。

2.5 北平頂猴血漿病毒載量

對北平頂猴血漿病毒載量進(jìn)行長期監(jiān)測發(fā)現(xiàn)(圖5)：感染后病毒載量持續(xù)升高，并于第2～3周達(dá)到峰值，兩組之間無明顯差異。隨后體重增加組血漿病毒載量持續(xù)下降，并于感染后第11周，血漿病毒載量小于103copies/mL。與之相比，體重減少組感染后第3～5周，血漿病毒載量出現(xiàn)明顯下降；第5周后，血漿病毒載量較為穩(wěn)定，感染后第11周，體重減少組病毒載量大于5×103copies/mL。

圖5 SIVmac239感染北平頂猴急性期的病毒載量Figure 5 Plasma viral load in the northern pig-tailed macaques in acute stage of SIVmac239 infection

2.6 病毒載量與胰島素抵抗相關(guān)性分析

通過對SIVmac239感染后第5周和第11周的北平頂猴血漿胰島素抵抗水平與血漿病毒載量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：北平頂猴感染第5周、第11周時，其胰島素抵抗水平與病毒載量呈正相關(guān)(r值分別為0.8571、0.8426；P值分別為0.0081、0.0098)，胰島素抵抗現(xiàn)象隨著血漿病毒載量的增加而增強(qiáng)(圖6)。

圖6 SIVmac239感染北平頂猴后第5周(A)和第11周(B)病毒載量與胰島素抵抗相關(guān)性分析Figure 6 Correlations between plasma viral load and insulin resistance at the 5th week (A) and 11th week (B) after SIVmac239 infection in the northern pig-tailed macaques

3 討論

本研究顯示，SIVmac239感染急性期，北平頂猴個體之間體重變化差異明顯，體重明顯增加及減少的實驗動物個體均存在。體重減少組與體重增加組血漿TNF-α、IL-6以及血脂四項無明顯變化。有趣的是，兩組實驗動物均出現(xiàn)明顯的葡萄糖代謝異常表現(xiàn)。體重增加組感染后胰島素水平下降；而體重減少組表現(xiàn)出明顯的血漿胰島素水平升高，并伴有顯著的胰島素抵抗現(xiàn)象。

Taylor等[12]研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)入艾滋病期的HIV感染者，其體重下降與IL-6水平升高明顯相關(guān)。Wig等[13]發(fā)現(xiàn)AIDS患者的血漿TNF-α濃度與艾滋病長期消瘦有重要聯(lián)系。HIV感染急性期，CD4+T細(xì)胞大量消耗及腸道黏膜損傷導(dǎo)致的微生物易位共同引起全身性的反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生[14]。然而，在本研究中，北平頂猴SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組的血漿IL-6和TNF-α水平無明顯差異，表明它們不是導(dǎo)致SIV感染急性期北平頂猴體重變化的原因。此外，Willig等[15]發(fā)現(xiàn)AIDS患者體重受血脂異常的影響。HIV感染慢性期，患者出現(xiàn)TC、LDL-CH和HDL-CH的降低并伴有TG的升高[16]。長期HAART治療也會引起脂類代謝異常及再分布的現(xiàn)象。本研究中，SIVmac239急性感染期北平頂猴血漿TC、TG、HDL-CH及LDL-CH與感染前相比均無明顯差異。因此，SIVmac239感染急性期，北平頂猴脂類代謝并不對其體重變化造成影響。

胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，是誘導(dǎo)血糖下降的唯一激素，與體重控制之間存在著直接聯(lián)系。SIVmac239感染急性期，體重增加組與體重減少組北平頂猴胰島素出現(xiàn)不同的變化趨勢。體重增加組的胰島素明顯減少，這與Noumegni等[17]發(fā)現(xiàn)AIDS患者胰島素水平降低導(dǎo)致體重增加相一致，但具體原因尚不明確。此外，Guillen等[18]在對秘魯感染HIV的成年人研究中發(fā)現(xiàn)，AIDS患者的HOMA-IR指數(shù)與體重指數(shù)之間存在相關(guān)性。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，體重減少組血漿胰島素水平明顯升高，HOMA-IR指數(shù)明顯增加，出現(xiàn)胰島素抵抗表現(xiàn)。因此，葡萄糖代謝異常是SIVmac239感染北平頂猴急性期導(dǎo)致體重變化的主要因素。

胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K)途徑。活化的過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ)能夠促進(jìn)PI-3K亞單位p85的表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄水平增加c-Cb1相關(guān)蛋白(CAP)，從而促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善胰島素抵抗[19]。然而，HIV復(fù)制過程中輔助蛋白Vpr可通過抑制PPAR-γ活性而影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能異常[20]，致使AIDS患者胰島素抵抗發(fā)生率大于非AIDS患者[21]。同時，蘭麗娟等[22]發(fā)現(xiàn)，HIV病毒載量是HOMA-IR的獨(dú)立影響因素，高病毒載量對AIDS患者的胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)面影響。在本研究中，北平頂猴SIVmac239感染后5周，兩組北平頂猴的血漿病毒載量開始出現(xiàn)不同的變化，到第11周時，兩組間的血漿病毒載量相差最大。我們通過對第5周和第11周的HOMA-IR指數(shù)變化與病毒載量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，病毒載量與胰島素抵抗具有相關(guān)性。SIVmac239感染急性期，體重減少組實驗動物病毒載量明顯高于體重增加組，高病毒載量的存在嚴(yán)重影響胰島β細(xì)胞的功能，進(jìn)而出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗及體重下降表現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SIV急性感染期，葡萄糖代謝異常是導(dǎo)致體重明顯下降的主要原因。峰值后持續(xù)存在的高病毒載量損傷胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而誘導(dǎo)體重下降。相比之下，急性期胰島素水平下降可能是體重增加的主要原因，但機(jī)制尚不明確。因此，HIV感染急性期對于葡萄糖代謝相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測有助于及時判斷胰島功能的損傷，有利于疾病進(jìn)展程度的預(yù)測及相應(yīng)治療策略的實施。