前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑在降脂治療中的應(yīng)用及其對(duì)心血管的保護(hù)意義

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一種與家族性高膽固醇血癥密切相關(guān)的基因，其表達(dá)產(chǎn)物PCSK9蛋白可與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合低密度脂蛋白受體(LDL-R)，促進(jìn)受體降解，導(dǎo)致可與LDL-C結(jié)合的受體數(shù)目減少，從而影響膽固醇代謝，引發(fā)高膽固醇血癥。LDL-C作為心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素與強(qiáng)有力預(yù)測(cè)因子，其水平的升高使病人發(fā)生血管事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[1]。隨著人們對(duì)PCSK9基因突變所致高膽固醇血癥的研究不斷深入，也為降膽固醇治療提供了新的思路。PCSK9抑制劑作為一種新型降脂藥，通過選擇性抑制PCSK9靶點(diǎn)達(dá)到降低LDL-C的目標(biāo)，進(jìn)而減少了心血管不良事件的發(fā)生[2]。因此，對(duì)PCSK9抑制劑的研究成為降脂治療的一個(gè)里程碑，具有十分重要的意義。

1 PCSK9與高膽固醇血癥

PCSK9最早在2003年被Seidah等[3]發(fā)現(xiàn)，是與家族性高膽固醇血癥發(fā)生相關(guān)的基因之一，是到目前為止已經(jīng)確定的9種哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶中的一種[4-5]，主要由肝臟分泌產(chǎn)生并釋放入循環(huán)血液中[6]。正常情況下，循環(huán)血液中的LDL-C與肝細(xì)胞表面的LDL-R結(jié)合后進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)完成代謝，隨后與LDL-C解離的LDL-R重新回到肝細(xì)胞表面繼續(xù)與血中LDL-C結(jié)合，降低血清LDL-C水平。PCSK9基因遺傳變異可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞表面LDL-R數(shù)量，間接引起血清LDL-C水平的變化。PSCK9基因在不同位點(diǎn)發(fā)生突變可引起不同的結(jié)局，可分為兩大類：功能獲得型突變與功能缺失型突變。S127R、F216R、D374Y、N425S*、R496W*等位點(diǎn)突變可使PCSK9基因發(fā)生功能獲得性突變[7-12]，PCSK9活性增強(qiáng)、降解減少[5，7]，與肝細(xì)胞表面LDL-R的結(jié)合增多，形成的PCSK9/LDLR復(fù)合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，到達(dá)溶酶體被降解，被降解的LDL-R無法重新回到細(xì)胞表面繼續(xù)利用，使肝細(xì)胞表面可與LDL-C結(jié)合的受體數(shù)目減少，從而影響循環(huán)血液中LDL-C在肝臟的代謝，最終導(dǎo)致LDL-C濃度升高[13-14]。相反，R46L、R97、G106R、Y142X、L253F、A443T、C679X等位點(diǎn)突變則可引起PCSK9功能缺失型突變[5， 11，15-16]，降低PCSK9的水平與活性，減少對(duì)LDL-R的降解，增加肝臟對(duì)LDL-C的清除，降低血清LDL-C水平。

2 PCSK9與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)

ASCVD是目前危害人類健康的最主要疾病之一，已成為導(dǎo)致我國城鄉(xiāng)居民死亡的首位死因[17]。眾所周知，LDL-C是ASCVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)也直接關(guān)系到心血管疾病的預(yù)后[18]。研究表明，LDL-C每降低40 mg/mL，罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)將下降22%[19]。PCSK9可通過介導(dǎo)LDL-R降解，間接引起LDL-C水平升高，進(jìn)而誘發(fā)ASCVD。但PCSK9導(dǎo)致ASCVD發(fā)生的途徑并不止這一條，還可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積、炎癥因子分泌、促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡等多條途徑直接導(dǎo)致ASCVD的發(fā)生發(fā)展。

2.1 PSCK9間接促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化 PCSK9基因發(fā)生功能獲得型突變可使其濃度升高、活性增加，從而加速LDL-R的降解，抑制血中 LDL-C代謝，使后者水平升高，間接增加罹患ASCVD的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 PCSK9直接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的過程中，有3種關(guān)鍵的細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞)參與其中。在血脂異常等危險(xiǎn)因素的持續(xù)作用下，血管內(nèi)皮受損，LDL-C通過內(nèi)皮進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜并完成氧化修飾形成氧化型LDL-C(oxLDL-C)；此時(shí)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也從內(nèi)皮細(xì)胞之間遷入內(nèi)膜下成為巨噬細(xì)胞，oxLDL-C可與巨噬細(xì)胞上的清道夫受體結(jié)合并被攝取，成為巨噬源性泡沫細(xì)胞，形成粥樣硬化最早期病變——脂質(zhì)條紋。值得注意的是，oxLDL-C與清道夫受體的結(jié)合并不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此兩者的結(jié)合沒有上限，可使oxLDL-C在巨噬源性無限蓄積，加速斑塊形成[20-21]。充滿氧化修飾脂蛋白的巨噬細(xì)胞可合成分泌多種促炎介質(zhì)和生長因子，促進(jìn)斑塊生長和炎癥反應(yīng)。在這些炎癥介質(zhì)與生長因子作用下，平滑肌細(xì)胞從動(dòng)脈內(nèi)膜遷移至內(nèi)膜并增殖，形成平滑肌源性泡沫細(xì)胞，合成分泌彈性蛋白、膠原等，構(gòu)成斑塊基質(zhì)。上述多重因素繼續(xù)共同作用，脂質(zhì)條紋逐漸演變?yōu)槔w維斑塊。

既往對(duì)PCSK9的研究主要集中于通過其對(duì)血脂的影響間接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，但Cariou等[22-23]的研究表明PCSK9除了通過影響血膽固醇水平進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化之外，其對(duì)血管壁的直接作用也是引起動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素，但具體機(jī)制并未闡明。Walley 等[24]的研究表明，PCSK9基因敲除小鼠體內(nèi)炎癥因子產(chǎn)生減少，證明PCSK9與炎癥因子的產(chǎn)生釋放有一定關(guān)聯(lián)。2014年，唐志晗[25]對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究，該研究首次證實(shí)PCSK9可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)聚集及炎癥因子的分泌，具體機(jī)制與CD36的表達(dá)上調(diào)及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。除此之外，PCSK9還與巨噬細(xì)胞凋亡有關(guān)。參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的3種主要細(xì)胞發(fā)生凋亡將會(huì)影響斑塊的穩(wěn)定性，增加急性冠脈綜合征等心血管不良事件的發(fā)生率[26]，其中以巨噬細(xì)胞的凋亡最為重要[27]。有研究表明，PCSK9 siRNA 導(dǎo)致的基因沉默可有效抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1 源性巨噬細(xì)胞的凋亡，從而證明PCSK9參與了巨噬細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而引發(fā)斑塊破裂[28]。除上述內(nèi)容外，是否還存在其他PCSK9對(duì)心血管直接損害的機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 PCSK9抑制劑的降脂應(yīng)用及心血管獲益

近年來應(yīng)用普遍的降膽固醇藥物主要有兩大類：以他汀類藥物為代表的3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制藥和以依折麥布等為代表的膽固醇吸收抑制劑。他汀類藥物是目前國內(nèi)外公認(rèn)的降低LDL-C的基石藥物，但不容忽視的是，該藥存在肝功能損害、橫紋肌溶解以及血糖升高等不良反應(yīng)，尤其對(duì)國人使用大劑量他汀類藥物的安全性與耐受性需要進(jìn)一步探討。另有研究表明，他汀類藥物會(huì)引起PCSK9的表達(dá)上調(diào)，與自身降脂作用相矛盾[29]。因此，需要更安全、更有效的降膽固醇藥物。PCSK9抑制劑作為一種新型的降膽固醇藥物，可選擇性地作用于PCSK9靶點(diǎn)，抑制PCSK9對(duì)LDL-R的降解作用，促進(jìn)LDL-C的代謝，達(dá)到降膽固醇效果，已被較多研究及臨床試驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的有效性和較高的安全性，并可降低心血管不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。主要包括單克隆抗體、反義寡核苷酸、小分子干擾RNA、模擬抗體蛋白以及小分子PCSK9抑制劑。

3.1 單克隆抗體 單克隆抗體是目前研發(fā)最為成熟的一類PCSK9抑制劑，主要作用機(jī)制是通過與PCSK9抗原特異性結(jié)合，減少PCSK9與LDL-R的結(jié)合，抑制LDL-R的降解，促進(jìn)LDL-C代謝，降低血膽固醇水平。

3.1.1 Alirocumab Alirocumab于2015年7月24日獲美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)正式批準(zhǔn)上市，是獲批上市的第一個(gè)PCSK9抑制劑。ODYSSEY研究是針對(duì)Alirocumab開展的Ⅲ期系列臨床研究，對(duì)Alirocumab的安全性、有效性及對(duì)心血管預(yù)后改善情況進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)。ODYSSEY COMBO Ⅱ研究將接受最大劑量他汀治療但仍控制不理想的高心血管風(fēng)險(xiǎn)高膽固醇血癥病人隨機(jī)分為兩組，其中Alirocumab組每2周皮下注射1次Alirocumab(75 mg)，同時(shí)口服安慰劑；對(duì)照組口服依折麥布10 mg/d，同時(shí)皮下注射安慰劑2周1次。從基線開始到治療后第24周，Alirocumab組LDL-C下降百分比為50.6%，而依折麥布組僅下降了20.7%；在藥物不良事件發(fā)生率方面，Alirocumab組(7.5%)略高于依折麥布組(5.4%)。ODYSSEY FH Ⅰ和Ⅱ研究結(jié)果表明，在雜合子家族性高膽固醇血癥病人中，與安慰劑組相比，Alirocumab可使LDL-C水平顯著降低。ODYSSEY LONG TERM研究納入了患有雜合性家族性高膽固醇血癥或具有高心血管風(fēng)險(xiǎn)的參與者共2341例，得到了與之前研究相同的結(jié)果——Alirocumab降

LDL-C效果確切，與基線相比降低了61.0%。2018年3月，最新臨床試驗(yàn)ODYSSEY OUTCOMES結(jié)果在ACC2018上正式發(fā)布，該研究共納入了18 924例經(jīng)強(qiáng)化他汀治療后LDL-C仍高于7 ng/L的急性冠脈綜合征病人，在現(xiàn)有治療的基礎(chǔ)上隨機(jī)分為兩組——Alirocumab干預(yù)組與安慰劑組，結(jié)果表明：Alirocumab組心血管主要終點(diǎn)事件減少15%，更令人出乎意料的是該組全因死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了15%，首次證明了PCSK9抑制劑能夠降低全因死亡率；而在安全性方面，除了注射部位局部反應(yīng)之外，Alirocumab并沒有出現(xiàn)新發(fā)糖尿病、出血性卒中、認(rèn)知障礙、白內(nèi)障等安全性問題[30]。

3.1.2 Evolocumab 在Alirocumab被FDA批準(zhǔn)上市1個(gè)月后，Evolocumab也獲批于美國上市，是一類全人源化單克隆抗體，目前Ⅲ期臨床試驗(yàn)已完成。EvolocumabⅠ期臨床研究分別納入56名健康志愿者和接受他汀治療的病人，結(jié)果表明，在健康人中，Evolocumab 組與安慰劑組相比，其LDL-C 水平下降約達(dá)60%；在已經(jīng)接受他汀治療的病人中，Evolocumab 組LDL-C下降達(dá)到了81%，充分證實(shí)了Evolocumab在降LDL-C水平方面的有效性；結(jié)果也顯示，在藥物使用過程中并無嚴(yán)重不良事件發(fā)生[31-32]。Ⅱ期臨床研究之一Gauss研究針對(duì)由于藥物不良反應(yīng)無法耐受至少兩種他汀類藥物的病人進(jìn)行了研究，結(jié)果同樣顯示Evolocumab可達(dá)到降低LDL-C目標(biāo)，證實(shí)了該藥物的良好耐受性，也為不能耐受他汀類藥物的高膽固醇血癥病人提供了新的治療方向。OSLER研究納入病人共4 464例，在給予標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上以2∶1的比例隨機(jī)分為Evolocumab治療組與安慰劑組，其中對(duì)Evolocumab組病人每月給予Evolocumab 420 mg皮下注射1次，將由心腦血管不良事件及死亡等所組成的復(fù)合終點(diǎn)設(shè)為主要終點(diǎn)，結(jié)果顯示：隨訪結(jié)束后，標(biāo)準(zhǔn)治療聯(lián)合Evolocumab治療可比單純標(biāo)準(zhǔn)治療組的LDL-C水平進(jìn)一步下降，差幅達(dá)61%。在心血管獲益方面，兩組均使心血管不良事件發(fā)生率降低，但差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33]。FOURIER 研究作為一項(xiàng)評(píng)價(jià)在優(yōu)化他汀治療的基礎(chǔ)上加用Evolocumab 能否進(jìn)一步降低心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的大型臨床研究，其結(jié)果由ACC2017一經(jīng)發(fā)表便引起了巨大反響，該項(xiàng)研究表明，Evolocumab組可使LDL-C下降59%，且與對(duì)照組相比，在優(yōu)化他汀治療的基礎(chǔ)上加用Evolocumab強(qiáng)化降脂治療，經(jīng)過平均2.2年的隨訪后，主要復(fù)合終點(diǎn)發(fā)生率下降15%，關(guān)鍵二級(jí)終點(diǎn)(包括心血管死亡、非致死性心梗和非致死性卒中)發(fā)生率降幅可達(dá)20%；同時(shí)，在不良反應(yīng)發(fā)生率方面兩組并無明顯差異[34]。FOURIER研究首次在循證醫(yī)學(xué)領(lǐng)域證實(shí)：給予強(qiáng)化降脂治療，將LDL-C水平控制在極低水平，不僅能夠改善預(yù)后，還具有良好的安全性；也更加充分地證實(shí)了Evolocumab的安全性、有效性及對(duì)心血管的保護(hù)意義。

3.2 反義寡核苷酸 反義寡核苷酸可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合于PCSK9 mRNA上，阻斷PCSK9轉(zhuǎn)錄過程，從根源上抑制PCSK9的合成，達(dá)到降低血膽固醇的目標(biāo)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，反義寡核苷酸效果顯著：給予高脂血癥小鼠人工合成反義寡核苷酸(ISIS-394814)治療6周后，可檢測(cè)到肝臟PCSK9表達(dá)水平下降了92%，LCL-R表達(dá)水平增加了1倍，血中總膽固醇和LDL-C 水平分別下降了53% 和38%[35]。目前，由瑞士羅氏公司研發(fā)的反義寡核苷酸類PCSK9抑制劑——SPC-5001正處于臨床試驗(yàn)階段。

3.3 小分子干擾RNA 小分子干擾RNA是一種分子量較小的雙鏈RNA，可通過靜脈或皮下注射進(jìn)入體內(nèi)，當(dāng)存在脂質(zhì)為載體時(shí)可順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與PCSK9轉(zhuǎn)錄過程中的mRNA結(jié)合并將其降解，達(dá)到特異性PCSK9基因敲除的效果。由Alnylam公司生產(chǎn)的此類藥物ALN-PCS也正處于臨床研究階段。

3.4 模擬抗體蛋白 正常情況下，PCSK9通過識(shí)別LDL-R上的EGF-A結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)與LDL-R的結(jié)合。模擬抗體蛋白與EGF-A結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似，從而干擾PCSK9與LDL-R的結(jié)合，抑制PCSK9對(duì)LDL-R的降解作用[36]。BMS-962476屬于此類藥物，由Adnexus公司與Bristol-Myers Squibb公司研制開發(fā)，目前還正處于臨床試驗(yàn)中。

3.5 小分子PCSK9抑制劑 在理論上，小分子PCSK9抑制劑與DNA、RNA以及蛋白質(zhì)均可以結(jié)合發(fā)揮作用，從而影響PCSK9合成、分泌以及與LDL-R結(jié)合的整個(gè)過程。但在實(shí)際研究中，小分子抑制劑與靶目標(biāo)結(jié)合的過程中缺少特定識(shí)別信號(hào)，無法保證作用的特異性[37]。因此，對(duì)此類PCSK9抑制劑的研究開發(fā)仍有較大一段距離。

4 小 結(jié)

PCSK9作為新發(fā)現(xiàn)的治療高膽固醇血癥的靶點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注，基于PCSK9靶點(diǎn)的新型降膽固醇藥物PCSK9抑制劑也正在走入更多人的視野。目前研究最為成熟的一類PCSK9抑制劑——單克隆抗體(Alirocumab、Evolocumab)已在美國批準(zhǔn)上市，多項(xiàng)大型臨床研究對(duì)其有效性、安全性及心血管長期獲益提供了較為有力的證據(jù)，為國內(nèi)外高膽固醇血癥病人，尤其是對(duì)他汀類藥物治療不理想或不耐受者帶來了新的曙光。雖然目前PCSK9抑制劑仍存在價(jià)格昂貴、缺乏長期使用的安全性數(shù)據(jù)等缺陷，但其為高膽固醇血癥及ASCVD的診治提出了更廣闊的思路，具有劃時(shí)代的意義，值得進(jìn)一步去探索和研究。