防治馬鈴薯病害的(5Z)-[2-(2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基)-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基]乙酸甲酯類的發(fā)現(xiàn)

付騁宇，張 波 編譯

(西安海關(guān)，陜西西安 710068)

“國(guó)際馬鈴薯年(2008)”的設(shè)定表明馬鈴薯一直而且繼續(xù)為全球重要的農(nóng)作物，全球數(shù)十億人口以馬鈴薯為最重要的非谷類糧食作物。2014年，全球馬鈴薯產(chǎn)量約38 200萬t，占所有根莖類作物產(chǎn)量的45%。中國(guó)是目前最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織2014年數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)(9 600萬t)、印度(4 600萬t)和俄羅斯(3 200萬t)的馬鈴薯產(chǎn)量幾乎占全球產(chǎn)量的一半。種類繁多的植物病害對(duì)農(nóng)業(yè)界和整個(gè)世界產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境影響，其中晚疫病(Phytophthora infestans)和青枯病(Erwinia tracheiphila)被農(nóng)民們認(rèn)為是影響馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害。此外，馬鈴薯早疫病菌(Alternaria solani)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani)、馬鈴薯炭疽病菌(Colletorichum coccodes)和絲核菌(Rhizoctonia solani)也是普遍發(fā)生的馬鈴薯病害。馬鈴薯產(chǎn)量差異分析說明，大部分生產(chǎn)者通過有效控制這些最常見的病害和使用優(yōu)質(zhì)、清潔種子能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)量翻番。化學(xué)控制可以降低病菌的感染。使用殺菌劑是化學(xué)控制成功的關(guān)鍵因素，但也會(huì)產(chǎn)生抗性。鑒于此，需要開發(fā)新型高效殺菌劑。

環(huán)外含有 C＝C的 1,3-噻唑烷-4-酮化合物被認(rèn)為是潛在的殺菌劑。因此，本研究的主要目標(biāo)是合成新的 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基化合物，并評(píng)估它們對(duì)馬鈴薯病害的抗菌活性。圖1中化合物的結(jié)構(gòu)特征為含有3個(gè)潛在生物活性基團(tuán)：α-氧酰胺、富馬酸酰胺和二甲酰亞胺。已有研究表明，α-酮酰胺能夠通過抑制組蛋白脫乙酰基酶(HDACs)活性來調(diào)節(jié)病原真菌和植物之間相互作用。HDACs作為基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果，對(duì)植物真菌的致病力具有重要作用。然而，通過HDACs控制真菌致病性的特異途徑知之甚少?；衔锝Y(jié)構(gòu)中的富馬酸酰胺片段會(huì)影響對(duì)葡萄糖胺-6-磷酸合酶(GlcN-6-P synthase)的抑制作用。葡萄糖胺-6-磷酸合酶被認(rèn)為是抗真菌藥物最具前景的分子靶標(biāo)之一。葡萄糖胺-6-磷酸合酶催化 D-氨基葡萄糖-6-磷酸生物合成的第一步，而D-氨基葡萄糖-6-磷酸是真菌中的幾丁質(zhì)、甘露糖蛋白等許多氨基糖大分子的前體。

圖1 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亞甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮結(jié)構(gòu)中的生物活性基團(tuán)

二甲酰亞胺干擾由組氨酸激酶和絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)組成的滲透信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，二甲酰亞胺殺菌劑已被應(yīng)用于保護(hù)多種作物防治植物病害。

鑒于以上情況，筆者認(rèn)為：對(duì)2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基的研究很有希望研發(fā)出多作用位點(diǎn)的殺菌劑。多位點(diǎn)作用機(jī)制的殺菌劑相對(duì)于單位點(diǎn)作用機(jī)制的殺菌劑來說抗藥性風(fēng)險(xiǎn)較低。

眾多對(duì) 1,3-噻唑烷-4-酮衍生物的研究都致力于其生物活性。文獻(xiàn)大多關(guān)注以雙鍵與吡唑、噁唑、1,3-二硫醇、四氫吡啶、噁嗪以及融合系統(tǒng)連接的1,3-噻唑烷-4-酮。以前筆者介紹過1種簡(jiǎn)便的2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基合成方法。然而，因其在溶液中不穩(wěn)定，對(duì)它們的生物活性尚未研究。

本研究計(jì)劃合成穩(wěn)定的 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基衍生物，并評(píng)價(jià)其離體殺菌活性。

1 材料和方法

1.1 儀器

用裝有ZnSe衰減全反射(ATR)附件的α傅立葉變換紅外光譜儀(FT紅外光譜，布魯克，埃特林根，德國(guó))測(cè)定紅外光譜。以四甲基硅烷(TMS，默克，德國(guó)達(dá)姆施塔特)為內(nèi)標(biāo)，二甲基亞砜(DMSO)-d6和二甲基甲酰胺(DMF)-d7(劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室，Tewksbury，美國(guó)MA)分別為流動(dòng)相，用Avance II光譜儀(Bruker，德國(guó)卡爾斯魯厄)測(cè)定1H和13C核磁共振(NMR)譜(分別為 400 MHz和 100 MHz)。GCMS-QP 2010“超”氣相色譜質(zhì)譜儀(島津，日本京都)質(zhì)譜儀，電子電離(EI)電壓為70 eV測(cè)定質(zhì)譜。用PE 2400 CHNS分析儀(珀金埃爾默儀器公司，美國(guó)康涅狄格州謝爾頓)進(jìn)行元素分析。UV-1800分光光度計(jì)(島津，日本京都)，在200～700 nm范圍內(nèi)測(cè)定吸收譜。用 SMP3熔點(diǎn)測(cè)定儀(Stuart，英國(guó)斯塔福德郡)測(cè)定熔點(diǎn)。

1.2 一般試驗(yàn)過程

根據(jù)文獻(xiàn)方法合成噻唑烷 1a-1f和硫代酰胺2a-2f?；衔?a-1d和2a-2f的波譜特性與文獻(xiàn)資料一致。

化合物 1a數(shù)據(jù)：熔點(diǎn)：285～287 ℃。C9H10N2O4S的分析計(jì)算值：C, 44.62; H, 4.16; N, 11.56。測(cè)量值：C, 44.63; H, 4.18; N, 11.59。

化合物 1b 數(shù)據(jù)：熔點(diǎn)：140～141 ℃。C15H14N2O4S的分析計(jì)算值：C, 56.59; H, 4.43; N, 8.80。測(cè)量值：C, 56.32; H, 4.42; N, 8.77。

化合物 1c 數(shù)據(jù)：熔點(diǎn)：195～196 ℃。C14H12N2O4S的分析計(jì)算值：C, 55.25; H, 3.97; N, 9.21。測(cè)量值：C, 55.00; H, 4.00; N, 9.18。

化合物 1d 數(shù)據(jù)：熔點(diǎn)：240～242 ℃。C15H14N2O5S的分析計(jì)算值：C, 53.88; H, 4.22; N, 8.38。測(cè)量值：C, 53.60; H, 4.20; N, 8.43。

化合物1e數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：80%；熔點(diǎn)：212～214 ℃；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2Z,5Z)異構(gòu)體(70%)：δ 3.76 (s, 3H, OMe), 6.42 (s, 1H, CH),6.56 (s, 1H, CH), 7.41～7.63(m, 3H, ArH), 7.68～8.01(m, 3H, ArH), 8.05～8.18 (m, 1H, ArH),10.97 (s, 1H,NH), 12.51 (s, 1H, NH); (2E,5Z)異構(gòu)體(30%)：δ 3.78(s, 3H, OMe), 6.04 (s, 1H, CH), 6.71 (s, 1H, CH),7.41～7.63 (m, 3H, ArH), 7.68～8.01 (m, 3H, ArH),8.05～8.18 (m, 1H, ArH), 10.97 (s,1H, NH), 11.78 (s,1H, NH)；電子電離質(zhì)譜分析(EI-MS, 70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：57 (1), 59 (2), 68 (10), 85 (11), 89 (2), 115 (13), 116(6), 127 (2), 143 (100), 144 (12), 180 (1), 212 (7), 354(M+,7), 355 (1)。C18H14N2O4S 的分析計(jì)算值：C, 61.01;H, 3.98; N,7.90。測(cè)量值：C, 61.05; H, 3.95; N, 7.99。

化合物1f數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：85%；熔點(diǎn)：262～264 ℃；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2Z,5Z)異構(gòu)體(72%)：δ 3.79 (s, 3H, OMe), 6.15 (s, 1H, CH),6.56 (s, 1H, CH), 7.36～7.42(m, 1H, ArH), 7.44～7.50(m, 1H, ArH), 7.55～7.63 (m, 1H, ArH),7.78～7.89 (m,3H, ArH), 8.41 (s, 1H, ArH), 10.42 (s, 1H, NH),12.48(s, 1H, NH); (2E,5Z)異構(gòu)體(28%)：δ 3.76 (s, 3H,OMe), 5.77 (s,1H, CH), 6.68 (s, 1H,－CH), 7.36～7.42(m, 1H, ArH), 7.44～7.50(m, H, ArH), 7.55～7.63 (m,1H, ArH), 7.78～7.89 (m, 3H, ArH), 8.34(s, 1H, ArH),10.40 (s, 1H, NH), 11.81 (s, 1H, NH)；電子電離質(zhì)譜分析(EI-MS, 70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：57 (1), 59 (2), 68(9), 85 (11), 89 (2), 115(14), 116 (6), 126 (1), 127 (2),143 (100), 144 (12), 149 (1), 180 (1), 212 (6), 354 (M+,13), 355 (2)。C18H14N2O4S的分析計(jì)算值：C,61.01; H,3.98; N, 7.90。測(cè)量值: C, 61.01; H, 4.02; N, 7.99。

1.3 化合物3a-3f的一般合成過程

將草酰氯(257 μL, 3.0 mmol, Acros Organics，比利時(shí)吉爾)加入 1,3-噻唑烷(1，1.0 mmol)的乙腈(12 mL，Cryochrom，俄羅斯圣彼得堡)溶液中，用力攪拌，然后在70 ℃攪拌反應(yīng)混合物4 h，冷卻至室溫。過濾得到沉淀物，用水(10 mL)洗滌，干燥，在乙醇中(Rosbio，俄羅斯圣彼得)重結(jié)晶。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3a數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：87% (258 mg)；熔點(diǎn)：277～284 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3295 (NH), 1770 (C=O)(弱), 1741(C=O)(中),1693 (C=O) (強(qiáng))；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.07(s, 3H, NMe), 3.08(s, 3H, NMe), 3.88(s, 3H, OMe),3.88(s, 3H, OMe), 6.91(s, 1H, CH), 6.93(s, 1H, CH)。附加質(zhì)子試驗(yàn)(APT)NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 23.57(NCH3), 23.80 (NCH3), 52.88 (OCH3), 52.90 (OCH3),98.45 (C4′=), 98.46 (C4′=), 119.14 (C9=), 119.23 (C9=),139.17 (C5=), 139.45 (C5=), 158.37 (C2=), 158.63(C2=), 161.90 (C=O), 161.97 (C=O), 165.45 (C=O),165.79 (C=O), 165.82 (C=O), 167.10 (C=O), 167.22(C=O), 167.99 (C=O), 176.39 (C3′=O), 180.44(C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析(70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39(14), 45 (6), 57(59), 59(46), 67(35), 71(17), 85(100),88(12), 94(15), 96(2), 116(68), 117(26), 118(5), 125(1),144(27), 145(3), 152(3), 153(2), 211(20), 212(2), 238(1),239(2), 265(1), 296(M+,11), 297(1)。C11H8N2O6S的分析計(jì)算值：C, 44.60; H, 2.72; N, 9.46。測(cè)量值：C, 44.22;H, 2.75; N, 9.30。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3b數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：57% (212 mg)；熔點(diǎn)：212～215 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3207 (NH), 1773 (C=O)(弱), 1727 (C=O)(中),1685 (C=O)(強(qiáng))。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.82 (s, 3H, Me), 3.83 (s, 3H, Me), 4.73 (s, 2H, CH2),6.91 (s, 1H, CH), 6.93 (s, 1H, CH), 7.23～7.36 (m, 5H,Ph)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 40.84 (CH2),41.08 (CH2), 52.87 (OMe), 52.91 (OMe), 98.27 (C4′=), 98.32(C4′=), 119.15 (C9=), 119.22 (C9=), 127.42 (Ar), 127.47 (Ar),127.58 (Ar), 127.68 (Ar), 128.46 (Ar), 128.49 (Ar), 136.00 (Ar),136.04 (Ar), 139.40 (C5=), 139.65 (C5=), 159.67 (C2=),159.93 (C2=), 161.73 (C=O), 161.78 (C=O), 165.21 (C=O),165.84 (C=O), 167.68 (C=O), 167.88 (C=O), 167.88 (C=O),176.00 (C3′=O), 180.11 (C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析(70 eV,m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39 (10), 45 (4), 57 (12), 59 (20), 65 (24),70 (23), 85 (61), 86 (15), 91 (75), 94 (11), 106 (42), 116(42), 118 (4), 119 (2), 143 (30), 144 (34), 149 (7), 152 (3),171 (11), 172 (6), 211 (30), 212 (7), 229 (3), 238 (17),239(2), 255(2), 256(13), 281(19), 282 (3), 287 (2), 312(2), 315 (19), 316 (7), 341 (3), 344 (14), 345 (3), 372 (M+,100), 373 (21)。C17H12N2O6S的分析計(jì)算值：C, 54.84; H,3.25; N, 7.52。測(cè)量值：C, 54.79; H, 3.12; N, 7.26。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3c數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：65% (233 mg)；熔點(diǎn)：230～232 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3314 (NH), 1761 (C=O)(弱), 1748 (C=O)(中),1688 (C=O)(強(qiáng))。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.83 (s, 3H, Me), 3.84 (s, 3H, Me), 6.94 (s, 1H, CH),6.96 (s, 1H, CH), 7.35～7.55(m, 5H, Ph)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.9 (OMe), 52.9 (OMe), 98.3(C4′=), 119.5 (C9=), 126.8 (Ar), 126.9 (Ar), 128.4 (Ar),128.8 (Ar), 131.4 (Ar), 139.2 (C5=), 139.5 (C5=), 160.0(C2=), 160.1 (C2=), 160.8 (C=O), 160.8 (C=O), 164.5(C=O), 165.8 (C=O), 167.2 (C=O), 167.5 (C=O), 167.6(C=O), 175.8 (C3′=O), 179.9 (C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析(70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39 (8), 45 (4), 57 (17), 59(23), 64 (15), 71 (10), 85 (61), 86 (20), 91 (31), 94 (6),116 (63), 117 (27), 119 (67), 120 (10), 144 (59), 145(6), 146 (4), 152 (5), 165 (1), 179 (2), 183 (2), 211(100), 212 (10), 288 (3), 330 (49), 331 (9), 358 (M+,56), 359 (12)。C16H10N2O6S的分析計(jì)算值：C, 53.63;H, 2.81; N, 7.82。測(cè)量值：C, 53.50; H, 2.69; N, 7.73。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3d數(shù)據(jù)：黃色粉末；收率：74% (245 mg)；熔點(diǎn)：259～261 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3202 (NH), 1777 (C=O)(弱), 1707 (C=O)(中), 1687 (C=O) (強(qiáng))。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.81 (s, 3H, MeO), 3.82 (s, 3H, MeO), 3.84 (s,3H, MeO), 6.93(s, 1H, CH), 6.95(s, 1H, CH), 7.04～7.10 (m, 2H, Ar), 7.26～7.34 (m, 2H Ar)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.91 (OMe), 52.95 (OMe),55.42 (OMe), 98.36 (C4′=), 114.12 (Ar), 119.35 (C9=),119.41 (C9=), 123.84 (Ar), 123.89 (Ar), 128.07 (Ar),128.17 (Ar), 139.53 (C5=), 139.26 (C5=), 159.03 (Ar),159.57 (C2=), 159.76 (C2=), 161.03 (C=O), 161.08(C=O), 164.75 (C=O), 165.85 (C=O), 167.37 (C=O),167.41 (C=O), 167.54 (C=O), 176.03 (C3′=O), 180.14(C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析(70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39 (1), 51 (3), 59 (4), 63 (1), 64 (1), 78 (6), 85 (11), 90(2), 94 (2), 106 (10), 116 (5), 121 (3), 122 (2), 134 (26),135 (2), 149 (100), 180 (2), 211 (2), 360 (6), 361 (1), 388(M+, 19), 389 (4)。C17H12N2O7S的分析計(jì)算值：C, 52.58;H, 3.11; N, 7.21。測(cè)量值：C, 52.91; H, 3.07; N, 7.16。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3e數(shù)據(jù)：磚紅色粉末；收率：70% (286 mg)；熔點(diǎn)：278～280 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3205 (NH), 1776 (C=O)(弱), 1724 (C=O)(中),1693 (C=O) (強(qiáng))。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.80 (s, 3H, OMe), 3.86 (s, 3H, OMe), 6.92 (s, 1H,CH), 6.95 (s, 1H, CH), 7.49～7.70 (m, 4H, naph), 7.90～7.98 (m, 1H, naphthyl), 8.01～8.12 (m 2H, naphthyl)；

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)：δ 52.90 (OMe),52.97 (OMe), 98.95 (C4′=), 119.36 (C9=), 119.43(C9=), 123.43 (Ar), 123.49 (Ar), 125.57 (Ar), 126.64(Ar), 126.90 (Ar), 126.95 (Ar), 128.14 (Ar), 128.37(Ar), 129.54 (Ar), 129.57 (Ar), 129.82 (Ar), 129.90(Ar), 133.70 (Ar), 139.39 (C5=), 139.59 (C5=), 159.73(C2=), 159.98 (C2=), 161.63 (C=O), 161.68 (C=O),165.03 (C=O), 165.86 (C=O), 165.92 (C=O), 167.67(C=O), 167.74 (C=O), 167.83 (C=O), 176.02 (C3′=O),180.14 (C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析(70 eV, m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39 (1), 45 (1), 57 (4), 59 (4), 63 (1), 71 (2), 85(11), 86 (3), 94 (1), 114 (11), 116 (6), 126 (1), 127 (3),140 (15), 141 (19), 169 (100), 170 (13), 190 (1), 211(2), 380 (5), 381 (1), 408 (M+, 20), 409 (5)。C20H12N2O6S的分析計(jì)算值：C, 58.82; H, 2.96; N,6.86。測(cè)量值：C, 58.48; H, 2.83; N, 6.97。

化合物(2E,5Z)-和(2Z,5Z)-3f數(shù)據(jù)：橙色粉末；收率：78% (319 mg)；熔點(diǎn)：278～281 ℃；紅外光譜υ (cm-1)：3199 (NH), 1770 (C=O)(弱), 1750 (C=O)(中),1689 (C=O) (強(qiáng))；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 3.86 (s, 3H, OMe), 3.89 (s, 3H, OMe), 6.94 (s, 1H,CH), 6.96 (s, 1H, CH), 7.47～7.59 (m, 3H, naphthyl),7.89～8.03 (m, 4H, naphthyl)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)：δ 52.87 (OMe), 52.92(OMe), 98.25 (C4′=),119.35 (C9=), 119.41 (C9=), 124.54 (Ar), 124.68 (Ar),125.42 (Ar), 125.57 (Ar), 126.75 (Ar), 126.90 (Ar),127.71 (Ar), 127.99 (Ar), 128.45 (Ar), 128.93 (Ar),139.37 (C5=), 139.65 (C5=), 160.42 (C2=), 160.56(C2=), 160.96 (C=O), 160.98 (C=O), 164.66 (C=O),165.83 (C=O), 167.36 (C=O), 167.78 (C=O), 167.96 (C=O),175.76 (C3′=O), 179.91 (C3′=O)；電子電離質(zhì)譜分析 (70 eV，m/z相對(duì)強(qiáng)度)：39 (1), 57 (2), 59 (4), 63 (1), 71 (1),85 (11), 86 (3), 94 (1), 114 (11), 116 (7), 126 (1), 127(3), 140 (14), 141 (18), 169 (100), 170 (13), 190 (1),211 (1), 380 (6), 381 (1), 408 (M+, 26), 409 (6)。C20H12N2O6S的分析計(jì)算值：C, 58.82; H, 2.96; N,6.86。測(cè)量值：C, 58.80; H, 2.90; N, 6.69。

1.4 化合物4d的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

用牛津Xcalibur 3 (鉬Kα輻射，λ=0.710 7 ?)(Wroclaw，波蘭)衍射儀進(jìn)行X-射線單晶衍射測(cè)定。圖2所示化合物結(jié)構(gòu)用SHELXS 97程序直接解析，再用SHELXL97進(jìn)行基于F2的全矩陣最小二乘法修正。對(duì)非氫原子進(jìn)行各向異性近似修正；氫原子以騎行模型進(jìn)行各向同性精修。化合物3d的晶體學(xué)數(shù)據(jù)存于劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心(CCDC 1523721)。

1.5 殺菌活性

測(cè)定了合成的所有化合物對(duì)馬鈴薯早疫病菌(RCAM 03318)、馬鈴薯干腐病菌(RCAM 0877)、絲核病菌(RCAM 01785)、晚疫病菌和馬鈴薯炭疽病菌(JS-171-5-76、JS-161-1)的離體殺菌活性。晚疫病菌為南開大學(xué)(中國(guó)天津)分離，炭疽病菌購(gòu)自俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物所(俄羅斯莫斯科)，其他菌株購(gòu)自俄羅斯國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物所(俄羅斯圣彼得堡)。

把病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(絲核病菌、馬鈴薯早疫病菌、晚疫病菌和炭疽病菌)或麥汁瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯干腐病菌)，25 ℃培養(yǎng)72 h。供試菌株在4 ℃培養(yǎng)基中保存。

圖2 化合物3d的晶體結(jié)構(gòu)

馬鈴薯葡萄糖瓊脂的制備：去皮馬鈴薯(200 g)、葡萄糖(20 g)、瓊脂(20 g)、蒸餾水(1 000 mL)。麥汁瓊脂培養(yǎng)基制備：將啤酒糟麥芽汁用紗布過濾，添加 2%瓊脂。對(duì)制備好的培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌(121 ℃，15 min)。

將50 mg化合物溶解在1 mL二甲基亞砜(DMSO)(Tatchempharmpreparaty，俄羅斯喀山)中，加入9 mL水，加熱，超聲，得到5 mg/mL溶液。在無菌條件下，用無菌軟木打孔器在接種培養(yǎng)7 d的供試真菌培養(yǎng)基上制取直徑4 mm、均勻的菌碟。在超凈工作臺(tái)中將1 mL供試溶液與9 mL加熱到60℃的培養(yǎng)基混合均勻，把混合液倒入培養(yǎng)皿，冷卻，凝固。將菌碟放置于培養(yǎng)皿中央?？瞻讓?duì)照為僅添加DMSO的培養(yǎng)基。以Consento SC 450 [6.7% (w/w)咪唑菌酮和 33.6% (w/w)霜霉威混合物] (拜耳農(nóng)作物科學(xué)公司，法國(guó)維爾弗朗什索恩)為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)化合物和對(duì)照處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在25 ℃培養(yǎng)(絲核菌培養(yǎng)48 h，晚疫菌、干腐菌和炭疽病菌培養(yǎng)72 h，早疫病菌培養(yǎng)120 h)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定真菌菌落直徑。根據(jù)Royse和Ries公式測(cè)定病原菌發(fā)育被抑制情況。

I (%)=[(C-T)/(C-4 mm)]×100

其中I (%)代表抑制徑向生長(zhǎng)的程度，T (mm)代表在每個(gè)特定濃度的化合物存在下菌落直徑的平均值，C(mm)代表在相同的測(cè)定條件下空白對(duì)照菌落的平均直徑。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

供試化合物4a-4f的致死中濃(EC50)通過相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)-生長(zhǎng)抑制率線性回歸法計(jì)算所得。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

烯酰胺與草酰氯的縮合反應(yīng)直接合成了 2,4,5-三氧吡咯烷衍生物。為了證實(shí)該方法適用于各種烯酰胺，筆者使用2-甲基-1,3-噻唑烷-4-酮衍生物1a-1f作為起始原料?；衔?1a-1f通過前面描述的方法制備。硫代酰胺類化合物 2a-2f與炔基甲酸酯反應(yīng)生成2-甲基-1,3-噻唑烷-4-酮類化合物1a-1f，產(chǎn)率為45%～80% (圖3)。噻唑烷1a-1f的C-5位環(huán)外雙鍵為Z構(gòu)型。C-2位環(huán)外雙鍵的構(gòu)型取決于溶劑介質(zhì)、分子內(nèi)相互作用(氫鍵和弱的相互作用)和空間位阻?；衔?a-1f的1H核磁共振光譜表明在DMSO-d6溶液中( 2E,5Z )-1a-1f和( 2Z,5Z )-1a-1f異構(gòu)體混合物共存，其中(2Z,5Z)-1a-1f異構(gòu)體占主導(dǎo)。

圖3 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亞甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮衍生物3a-3f的合成

1,3-噻唑烷-4-酮類化合物 1a-1f與草酰氯在70 ℃、干燥MeCN中成功反應(yīng)，生成3a-3f粗產(chǎn)物，收率57%～87% (圖3)。化合物3a-3f具有Z和E異構(gòu)體，黃色或磚紅色，具有較為寬泛的熔點(diǎn)范圍?；衔?a-3f的結(jié)構(gòu)通過紅外光譜、質(zhì)譜、1H和13C核磁共振、元素分析和X射線數(shù)據(jù)進(jìn)行確定。質(zhì)譜測(cè)定發(fā)現(xiàn) 3a-3f都具有一個(gè)分子離子峰(M+, 11%～100%)。羰基在1 770～1 777 cm-1表現(xiàn)出弱振動(dòng)，1 724～1 748 cm-1表現(xiàn)中強(qiáng)度震動(dòng)，1 685～1 693 cm-1表現(xiàn)出強(qiáng)震動(dòng)。此外，化合物3d的單晶X射線衍射進(jìn)一步證實(shí)了(2Z,5Z)-3d化合物(圖2)的結(jié)構(gòu)。

化合物3a-3f的1H和13C 核磁共振波譜顯示每組為雙信號(hào)。表1 (原子編號(hào)方案見圖4 )列出了2個(gè)異構(gòu)體的OMe和C(9)－H的特征信號(hào)。由于溶劑的快速交換，1H核磁共振譜上未發(fā)現(xiàn)NH基團(tuán)信號(hào)。在室溫，(2Z,5Z)-3a-3f和(2E,5Z)-3a-3f異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)換速度慢于核磁共振時(shí)標(biāo)。在1H核磁共振變溫試驗(yàn)(DMF-d7)中，化合物3a在δ 3.10、3.11 ppm 2個(gè)信號(hào)峰隨著溫度的升高越來越近，最后合為一峰(圖5)。C5=C9鍵的存在降低了C2=C4鍵的推拉效應(yīng)，阻礙(2E,5Z)-3和(2Z,5Z)-3異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)換。13C 核磁共振光譜在 δ 179.9～180.1、175.8～176.1 ppm的特征信號(hào)歸屬于 C(3′)=O羰基。正如筆者之前報(bào)道的，4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亞甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮只呈現(xiàn)一組平均信號(hào)，在δ 179～180.1未發(fā)現(xiàn)低場(chǎng)信號(hào)。此外，2,4,5-三氧吡咯烷酮基團(tuán)在185～206 ppm有信號(hào)。而參與烯醇化和分子內(nèi)氫鍵形成的氧代基團(tuán)(oxo group)碳原子明顯更不被屏蔽。文獻(xiàn)材料證實(shí)了2,4,5-三氧吡咯烷的這種現(xiàn)象。就(2E,5Z)-3a-3f的結(jié)構(gòu)來說，C3′羰基信號(hào)向低場(chǎng)位移可被解釋為NH???O=C3′分子內(nèi)氫鍵的形成與烯醇化反應(yīng)可能性低的原因。因此，高場(chǎng)信號(hào)歸屬于(2Z,5Z)-3a-3f構(gòu)象的C3′羰基。

表1 構(gòu)型異構(gòu)體3a-3f的1H和13C 核磁共振化學(xué)位移(δ,單位ppm)

圖4 4-(4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亞甲基)吡咯烷-2,3,5-三酮3a-3f異構(gòu)化的一般途徑

2.2 殺菌活性

測(cè)試了 2,4,5-三氧吡咯烷-3-亞甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-5-亞甲基類化合物 3a-3f對(duì)造成全球馬鈴薯減產(chǎn)的5種馬鈴薯病原菌的殺菌活性。為了進(jìn)行對(duì)比，以對(duì)馬鈴薯和番茄霉病(晚疫病)有內(nèi)吸活性，并對(duì)馬鈴薯早疫病有預(yù)防效果的商品殺菌劑 Consento SC 450作為陽(yáng)性對(duì)照。Consento是霜霉威鹽酸鹽和咪唑菌酮混合殺菌劑。咪唑菌酮是咪唑啉酮類內(nèi)吸性葉用殺菌劑，用于防治卵菌綱病害，比如早疫病和晚疫病。霜霉威鹽酸鹽是對(duì)藻菌綱病菌(腐霉菌屬和疫霉菌屬)具有預(yù)防作用的內(nèi)吸性殺菌劑。

圖5 測(cè)定化合物3a (DMF-d7)的變溫1H核磁共振譜

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有 3a-3f化合物對(duì)供試菌株都有不同程度的活性(表2)。芐基連于2,4,5-三氧吡咯環(huán)的2,4,5-三氧吡咯烷-1,3-噻唑烷 3b化合物對(duì)所有菌株均表現(xiàn)出最佳的抗菌活性。該化合物對(duì)干腐病菌、核絲菌和晚疫病菌的徑向生長(zhǎng)抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)早疫病菌的活性與陽(yáng)性對(duì)照相似。因此，以2,4,5-三氧吡咯烷的 N取代結(jié)構(gòu)在抗菌活性中起主要作用。

表2 化合物3a-3f對(duì)馬鈴薯植物病原菌的抑制活性

評(píng)估了化合物 3a-3f對(duì)植物病原真菌和卵菌亞綱真菌(晚疫病菌)的毒性(表 3)。結(jié)果顯示，化合物3b抗真菌活性最好，EC50為0.052～0.445 mg/mL。2,4,5-3氧吡咯烷-1,3-噻唑烷化合物3b對(duì)馬鈴薯早疫病菌和晚疫病菌表現(xiàn)出最高的活性。因此，化合物3b很有潛力進(jìn)一步開發(fā)為新型殺菌劑。

表3 化合物3a-3f的致死中濃度