有髯鳶尾種質(zhì)離體保存研究

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(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061； 2.河北省林木良種工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050061； 3.天津創(chuàng)世生態(tài)景觀建設(shè)股份有限公司，天津 300000； 4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000)

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究及植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。離體保存法作為植物種質(zhì)資源圃活體保存替代技術(shù)，是保證植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的一種新興途徑[2-3]，可以有效延長(zhǎng)組培苗繼代周期，避免頻繁繼代，節(jié)約培養(yǎng)成本，并且使材料一直處于生長(zhǎng)狀態(tài)，保持種質(zhì)優(yōu)良特性。相關(guān)研究[4-7]表明，甘露醇、山梨醇等高滲保透劑以及CCC、ABA、PP333等植物生長(zhǎng)延緩劑可以有效抑制植物組培苗的高生長(zhǎng)，使組培苗節(jié)間縮短，并矮化、壯化植株，已經(jīng)在南天竹[8]、馬鈴薯[5]、茶樹[9]等植物的研究上取得了較有價(jià)值的研究成果。

有髯鳶尾(BeardedIris)，為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)多年生草本植物，是垂瓣上有髯毛附屬物的鳶尾品種的統(tǒng)稱[10-11]。目前，全世界有髯鳶尾已超過(guò)2萬(wàn)余種[12]，花色包括了除正紅色以外所有的顏色，有髯鳶尾不同的花色組合不僅可以美化、香化環(huán)境，還能形成良好的園林綠化景觀。在現(xiàn)階段，有髯鳶尾種質(zhì)資源主要依靠活體保存[13]，而活體保存需要現(xiàn)代設(shè)施條件，保存成本較高，且易受病蟲害等的影響而造成珍貴品種資源的流失。此外，在生產(chǎn)過(guò)程中，有髯鳶尾組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗需4～6個(gè)月的時(shí)間[14-16]，且外植體花蕾的采集受花期限制，不可避免出現(xiàn)頻繁繼代培養(yǎng)，造成人力物力浪費(fèi)以及可能發(fā)生變異等問(wèn)題。因此，為克服傳統(tǒng)活體保存方法的缺點(diǎn)，解決組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，開展有髯鳶尾種質(zhì)資源離體保存研究迫在眉睫。鑒于此，選用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑，對(duì)有髯鳶尾的離體保存方法進(jìn)行了初步研究，以期為有髯鳶尾的種質(zhì)離體保存優(yōu)化、組培產(chǎn)業(yè)化以及種質(zhì)創(chuàng)新提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇穩(wěn)定、正常生長(zhǎng)的有髯鳶尾1A(印度首領(lǐng)×白與藍(lán))繼代5次組培苗為試驗(yàn)材料，在河北省林業(yè)科學(xué)研究院組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行有髯鳶尾種質(zhì)離體保存研究。

1.2 試驗(yàn)方法

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇，每種藥劑的質(zhì)量濃度梯度見(jiàn)表1。對(duì)照(CK)不添加藥劑。培養(yǎng)基中瓊脂為6.5 g/L，蔗糖為30.0 g/L，pH值為5.8～6.0，采用塑料封口膜封口，高壓滅菌。滅菌溫度為121 ℃，滅菌時(shí)間為18 min。將有髯鳶尾1A組培苗以芽間剝離的方式分成3株/叢，接種到培養(yǎng)基中，每處理接種15瓶，每瓶接種3叢。每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)室中溫度為23～25 ℃，光照強(qiáng)度為1 000～1 500 lx，光照時(shí)數(shù)為12 h/d(每日的6：00—18：00為光照時(shí)間)。

表1 有髯鳶尾1A組培苗種質(zhì)離體保存不同藥劑質(zhì)量濃度設(shè)置

注：P、B、C、A、G、S分別代表PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

接種完成后，隨時(shí)觀察、記錄組培苗的生長(zhǎng)狀況。接種120 d時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高。其中，株高為株叢基部到頂部之間的距離(不包括根莖)。

存活率=存活株數(shù)/接種株數(shù)×100%；

黃葉率=黃葉株數(shù)/接種株數(shù)×100%；

增殖倍數(shù)=增殖后芽數(shù)/起始芽數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行表格記錄與數(shù)據(jù)運(yùn)算，用DPSv 7.05進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)不同處理的離體保存效果，對(duì)存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高的隸屬值進(jìn)行累加，求取平均值。

X(u)= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X(u)為各指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加后求取的平均值。X為某一處理的某一指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax為所有處理在該指標(biāo)中的最大值，Xmin為所有處理在該指標(biāo)中的最小值。隸屬函數(shù)值平均值越大，組培苗生長(zhǎng)越好，離體保存效果也越好[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PP333對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表2可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的PP333對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，P1—P5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢?jiàn)，不同質(zhì)量濃度PP333均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨著PP333質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，而增殖倍數(shù)則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，P4即PP3338.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為3.1，株高為6.8 cm。PP333質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)對(duì)組培苗產(chǎn)生毒害作用。另外，P4處理有少量生根現(xiàn)象，這可能與適宜濃度的PP333能促進(jìn)鳶尾組培苗的生根生長(zhǎng)有關(guān)。

表2 不同質(zhì)量濃度PP333對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

注：不同大、小寫字母表示在0.01、0.05水平差異，下同。

2.2 B9對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表3可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的B9對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異分別達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，B1—B5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢?jiàn)，不同質(zhì)量濃度B9均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨著B9質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)，而增殖倍數(shù)則是先上升后下降。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，B5即B915.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，黃葉率為50.0%，增殖倍數(shù)為2.9，株高為 4.9 cm。

表3 不同質(zhì)量濃度B9對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

2.3 CCC對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表4可以看出，添加不同濃度的CCC對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異分別達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，C1—C5處理組培苗存活率均在75.0%以上，CK組培苗全部死亡。可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度CCC均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨CCC質(zhì)量濃度的增加，株叢存活率逐漸升高，黃葉率依次降低，增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，C5即CCC 40.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為3.4，株高為5.8 cm。

表4 不同質(zhì)量濃度CCC對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

2.4 ABA對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表5可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的ABA對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異分別達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，A1—A5處理組培苗存活率均在66.8%以上，CK組培苗全部死亡。可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度ABA均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨著ABA質(zhì)量濃度的增加，株叢存活率、增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，而株叢黃葉率則表現(xiàn)為先降低后上升的趨勢(shì)。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，A3即ABA 4.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為91.8%，黃葉率為13.2%，增殖倍數(shù)為2.5，株高為3.4 cm。ABA添加濃度過(guò)高，對(duì)株叢生長(zhǎng)的抑制作用過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重影響株叢的正常生長(zhǎng)與增殖。

表5 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

2.5 甘露醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表6可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的甘露醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異分別達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，G1—G4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度甘露醇均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨著甘露醇質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，而增殖倍數(shù)則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，G4即甘露醇40.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

表6 不同質(zhì)量濃度甘露醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

2.6 山梨醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

由表7可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的山梨醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)部分處理間差異分別達(dá)到顯著或極顯著水平。接種120 d時(shí)，S1—S4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢?jiàn)，不同質(zhì)量濃度山梨醇均對(duì)有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)起到較強(qiáng)的抑制作用。隨著山梨醇質(zhì)量濃度的增加，增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，而株叢黃葉率則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。綜合考慮抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，S3即山梨醇30.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.2，株高為4.4 cm。山梨醇添加濃度過(guò)高，對(duì)株叢生長(zhǎng)的抑制作用過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重影響株叢的生長(zhǎng)與增殖。

表7 不同質(zhì)量濃度山梨醇對(duì)有髯鳶尾1A組培苗生長(zhǎng)的影響

2.7 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評(píng)價(jià)

由表1—7可知，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個(gè)指標(biāo)的最優(yōu)處理并不相同，因此，對(duì)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)。由綜合評(píng)價(jià)結(jié)果(表8)可知，G4處理的綜合評(píng)價(jià)值最高，達(dá)到81.87；其次是G3處理，綜合評(píng)價(jià)值為81.66；再次是S3處理，綜合評(píng)價(jià)值為81.44；P5、C5、P4、C4 4個(gè)處理的綜合評(píng)價(jià)值也均在80以上，組培苗生長(zhǎng)狀況均良好。而A5處理綜合評(píng)價(jià)值最低，僅為37.06，組培苗株叢受害嚴(yán)重。綜上可知，有髯鳶尾有髯鳶尾1A組培苗的種質(zhì)離體保存最佳處理為G4，組培苗接種120 d時(shí)，株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

表8 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評(píng)價(jià)

3 結(jié)論與討論

常規(guī)組織培養(yǎng)條件下，有髯鳶尾的最佳繼代周期約為30 d。當(dāng)繼代周期>30 d時(shí)，會(huì)導(dǎo)致株叢出現(xiàn)葉片黃化、腐爛、衰老，乃至死亡，不利于下一代的增殖培養(yǎng)。相關(guān)研究表明，甘露醇與山梨醇是同分異構(gòu)體，屬于惰性物質(zhì)，不易被外植體吸收，可以提高培養(yǎng)基的滲透壓，抑制植物細(xì)胞吸水，延緩植株生長(zhǎng)[18]；CCC是一種季銨鹽類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有矮化植株的作用[8]；ABA具有抗赤霉素的作用，降低RNA聚合酶的活性，抑制DNA的合成，從而抑制材料的生長(zhǎng)[19]；B9是一種高效低毒的植物生長(zhǎng)延緩劑，可抑制莖端下部區(qū)域的細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[5]；PP333是植物生長(zhǎng)延緩劑[6]，可抑制赤霉素的生物合成，使植株節(jié)間縮短，株型緊湊，矮小健壯。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同質(zhì)量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇均能有效抑制有髯鳶尾1A組培苗的生長(zhǎng)，株叢保存培養(yǎng)120 d仍生長(zhǎng)正常，不需要轉(zhuǎn)接繼代，極大地延長(zhǎng)了繼代周期?？梢?jiàn)，使用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑進(jìn)行有髯鳶尾的種質(zhì)離體保存均具有較高的可行性。

利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到植物抗性、生理、繁殖等[20-23]研究中，并得到大多數(shù)學(xué)者和專家的認(rèn)可。綜合考慮有髯鳶尾1A組培苗培養(yǎng)120 d的抑制效果及株叢生長(zhǎng)狀況，PP333、B9、CCC、ABA和甘露醇、山梨醇最適質(zhì)量濃度分別為8.0、15.0、40.0、4.0 mg/L和40.0、30.0 g/L。本研究條件下，ABA、山梨醇質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)株叢生長(zhǎng)的抑制作用過(guò)大，嚴(yán)重影響株叢的生長(zhǎng)與增殖，表明藥劑添加濃度過(guò)高，反而會(huì)產(chǎn)生毒害作用。這與在文心蘭[2]、草莓[7]、香果樹[24]、葡萄[25]等植物上的離體保存研究結(jié)果相似。

另外，PP3338.0 mg/L處理中組培苗出現(xiàn)少量生根現(xiàn)象，這可能與適宜濃度的PP333能促進(jìn)鳶尾組培苗的生根生長(zhǎng)有關(guān)?？梢?jiàn)，添加PP333后，組培苗株高被抑制，反而促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)，但組培苗生根現(xiàn)象是否會(huì)影響種質(zhì)保存的時(shí)間，以及是否會(huì)引發(fā)植株變異，還需進(jìn)一步研究。

綜合存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高及隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果，有髯鳶尾1A組培苗的種質(zhì)離體保存最佳處理為G4，即甘露醇40.0 g/L的處理，組培苗接種120 d時(shí)，株叢存活率為100%，無(wú)黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

另外，鳶尾離體種質(zhì)保存在鳶尾種質(zhì)資源研究中尚屬首例，本研究?jī)H對(duì)有髯鳶尾1A組培苗接種120 d的離體保存效果進(jìn)行了探索，后續(xù)將在更長(zhǎng)時(shí)間的種質(zhì)保存與恢復(fù)方面進(jìn)行深入研究。