不同誘導(dǎo)條件對樹鼩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響*

苗雨潤 李 娜 匡德宣 宋慶凱 袁 圓王 璇 張志成 陸彩霞

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118）（2.河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古自治區(qū)蜱媒人畜共患傳染病重點實驗室，巴彥淖爾市 015000）

樹鼩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）具有廣泛的多分化潛能，可通過如化學(xué)藥物、物理環(huán)境改變、細(xì)胞因子等多種方式誘導(dǎo)其分化[1]。其具有來源廣泛、病原微生物感染率低，生物學(xué)性能穩(wěn)定、免疫原性較低和負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，同種異體移植免疫排斥反應(yīng)較低，不產(chǎn)生移植物抗宿主病等優(yōu)點[2]，是自體干細(xì)胞移植治療和構(gòu)建組織工程器官的理想種子細(xì)胞，為組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)提供了新思路。樹鼩作為一種新型實驗動物，由于其在分類學(xué)上比嚙齒類與人類更相近，且繁殖飼養(yǎng)難度要簡單于獼猴類，近年來受到廣泛關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于人類疾病模型的構(gòu)建及相關(guān)領(lǐng)域的研究[3]，我們之前已成功將樹鼩BM-MSCs進(jìn)行了分離培養(yǎng)及鑒定，但由于不同物種的BM-MSCs對相同誘導(dǎo)劑反應(yīng)性的不同，樹鼩BM-MSCs向成骨誘導(dǎo)過程中，市售的其他物種的成骨誘導(dǎo)液均不能很好地達(dá)到成骨誘導(dǎo)的目的，現(xiàn)有的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基存在對樹鼩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)效率不理想、成骨誘導(dǎo)分化的專一性不強(qiáng)、無法成功誘導(dǎo)成骨分化的問題。所以我們一直致力于尋找可以應(yīng)用于樹鼩BM-MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的最高效的誘導(dǎo)方法[4]。本實驗初步探討了不同濃度的化學(xué)藥物及細(xì)胞因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力的影響并加以鑒定，研究其形態(tài)特征和反應(yīng)性差異，探索樹鼩BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，有望開發(fā)一種針對樹鼩BM-MSCs的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)鑒定的試劑盒，為樹鼩骨髓BM-MSCs應(yīng)用于人類相關(guān)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

F1代成年樹鼩雌雄不限，體質(zhì)量110～130 g，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證 SCXK（滇）K2013-0001，使用許可證SYXK（滇）K2013-0001。

1.2 主要試劑及儀器

人淋巴細(xì)胞分離液（灝洋生物制品有限公司，天津），DMEM/F12（Thermo，美國），高糖 DMEM（HyClone，美國），DMEM（HyClone，美國），胎牛血清（HyClone，美國），地塞米松（Enzo，美國），維生素 C（Solarbio，北京），β-磷酸甘油鈉（Sigma，美國），DMSO（Sigma，美 國），茜 素 紅 （Solarbio，北 京），BMP-2（PeproTech，美國），堿性磷酸酶試劑盒（西亞試劑，山東），胰酶（BI，以色列），肝素鈉（Sigma，美國），青霉素（HyClone，美國），鏈霉素（HyClone，美國），倒置顯微鏡（Nikon，日本），二氧化碳孵箱（Thermo，美國）。

1.3 BM-M SCs細(xì)胞

由本實驗室分離鑒定保存[4]。

1.4 實驗方法

1.4.1 樹鼩BM-MSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)：取第3代樹鼩BM-MSCs，0.25%胰酶消化后以1x104個/m L接種12孔板，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞貼壁融合至90%后，分7組進(jìn)行誘導(dǎo)，各組培養(yǎng)液配方參照表1。每隔48 h換液，誘導(dǎo)18 d后進(jìn)行堿性磷酸酶和茜素紅染色。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方優(yōu)化Table 1 Optim ization of form ulation of differetiation cultu rem edium

1.4.2 茜素紅染色：分別取P3代細(xì)胞和P3代誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d的7組細(xì)胞，用 PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 min；95%乙醇室溫固定10 min，雙蒸水洗滌3次；1%茜素紅-Tris-HCL，每孔 500～1 000 μL，37 ℃，30 m in；雙蒸水洗滌 4 次，每次 5 m in；加入雙蒸水1 m L，顯微鏡下觀察。

1.4.3 堿性磷酸酶染色：分別取P3代細(xì)胞和P3代細(xì)胞誘導(dǎo)18 d后的7組細(xì)胞，用PBS（pH7.2～7.4）洗2～3次，每次2 m in；95%乙醇室溫固定10 m in，雙蒸水洗滌3次；用堿性磷酸酶試劑盒染色，雙蒸水洗滌4次，每次5 min；加入雙蒸水1 mL，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩BM-M SCs在不同誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞分化的堿性磷酸酶染色結(jié)果

P3代樹鼩BM-MSCs在不同誘導(dǎo)條件下體外成骨誘導(dǎo)18 d后，ALP染色結(jié)果見圖1。如圖1所示，加入成骨誘導(dǎo)液的P3代細(xì)胞，在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)18 d后，堿性磷酸酯酶染色大多為陽性（圖1）。說明樹鼩BM-MSCs成骨誘導(dǎo)18 d，已具有成骨細(xì)胞的特征。由于ALP染色步驟及方法完全相同，故采用染色深淺度作為衡量分化優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示不同組別的ALP染色結(jié)果差異較大，可以看出A、B組的染色結(jié)果明顯優(yōu)于其余五組，這說明這兩組誘導(dǎo)培養(yǎng)液更適于樹鼩BM-MSCs的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.2 樹鼩BM-M SCs在不同誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞分化的茜素紅染色結(jié)果

圖1 樹鼩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)第18天后堿性磷酸酶染色結(jié)果Fig.1 Ostepgenic induction of Tupaia bone m ar row m esenchym al stem cells at 18 d by alkaline phosphatase staining

圖2 樹鼩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)第18天后茜素紅染色Fig.2 Ostepgenic induction of Tupaia bone m arrow m esenchym al stem cells at 18 d by alizarin red staining.

P3代樹鼩BM-MSCs分別在不同組別誘導(dǎo)培養(yǎng)液的條件下體外成骨誘導(dǎo)18 d后，茜素紅染色結(jié)果如圖2所示。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的P3代BMMSCs細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)由梭形形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿切巍⒎叫?、鱗片狀等，在成骨誘導(dǎo)18 d時形成鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性（圖2）說明此時樹鼩 BM-MSCs成骨誘導(dǎo)成功，已形成成熟的成骨細(xì)胞。在 A、B、C、D、E組都觀察到有不同數(shù)量程度的明顯的鈣化結(jié)節(jié)，這證明樹鼩BM-MSCs被成功地誘導(dǎo)為成熟的成骨細(xì)胞。但組別不同，其誘導(dǎo)程度也呈現(xiàn)明顯差異。通過血球計數(shù)板計算在相同細(xì)胞數(shù)的前提下有多少個礦質(zhì)結(jié)節(jié)形成作為評價分化標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示A、B組誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于其余五組誘導(dǎo)培養(yǎng)液，此染色結(jié)果與 ALP染色結(jié)果基本相同，說明A、B這兩組培養(yǎng)液的誘導(dǎo)效率更佳。

3 討論

BM-MSCs可以通過不同的方法誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，其相關(guān)實驗的可行性在人、大鼠、小鼠、兔、犬、猴、山羊等不同物種間先后得到驗證[5]。王善正等[6]通過用自體富血小板血漿在體外培養(yǎng)兔的BMSCs，發(fā)現(xiàn)經(jīng)自體激活富血小板血漿誘導(dǎo)的 BMMSCsⅡ型膠原α1鏈基因和聚集蛋白聚糖基因表達(dá)明顯增高，證明自體激活富血小板血漿具有促進(jìn)兔BM-MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的潛能。近年來使用中藥成骨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也是一大研究熱點，武密山等[7]，顧巧麗等[8]，及楊淵等[9]分別使用川續(xù)斷皂苷VI、姜黃素及柚皮甙成功實現(xiàn)不同動物的BM-MSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)。黃曉丹等[10]發(fā)現(xiàn)雷奈酸鍶可通過TGF-β1/Smad通路促進(jìn)大鼠BMMSCs向成骨細(xì)胞分化。此外還有許多方法可以將BM-MSCs成骨誘導(dǎo)，現(xiàn)最經(jīng)典也是最常用的誘導(dǎo)方法有兩種，即地塞米松與β-磷酸甘油鈉作為誘導(dǎo)物及使用BMP-2作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。有報道證明，BMP-2的激活渠道包括Smads途徑與MAPKs途徑[11]。BMP-2的信號通過這兩條途徑均可傳入細(xì)胞，激活轉(zhuǎn)錄因子 Dlx5，Cbfa1和 Osx，來啟動成骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)[12]。而化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)液中的地塞米松的作用是抑制細(xì)胞增殖，限制細(xì)胞分化，并通過激活Osx來實現(xiàn)信號傳導(dǎo)，從而實現(xiàn)誘導(dǎo)分化功能。β-磷酸甘油鈉的主要功能是為細(xì)胞形成礦物結(jié)節(jié)提供磷元素，維生素C則與在礦化結(jié)節(jié)的形成過程中的膠原合成直接相關(guān)[13]。本研究選擇了最常用也是公認(rèn)誘導(dǎo)效率最高的這兩種方法進(jìn)行研究，來探索將樹鼩BM-MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的最佳配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

本研究采用本實驗室分離保存的樹鼩BMMSCs，使用7種不同配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)液對樹鼩BMMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，并使用ALP染色及茜素紅染色的方法來鑒定誘導(dǎo)結(jié)果及不同誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)效率。通過ALP染色及茜素紅染色的結(jié)果來評估成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果，結(jié)果顯示 A組及 B組在ALP染色結(jié)果中比其余各組陽性染色結(jié)果更佳，且在相同計數(shù)細(xì)胞的前提下可以形成更多的礦質(zhì)結(jié)節(jié)?；瘜W(xué)藥物抗壞血酸、地塞米松及β-磷酸甘油鈉和細(xì)胞因子BMP-2都可以將樹鼩BM-MSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，但不同配比的誘導(dǎo)結(jié)果具有顯著差異。結(jié)果顯示，高糖DMEM培養(yǎng)液相對于 DMEM/F12培養(yǎng)液來說更適合作為誘導(dǎo)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。100μmol/L維生素 C+1μmol/L地塞米松 +10 mmol/Lβ-磷酸甘油鈉的配比配制（即A組）的誘導(dǎo)培養(yǎng)液在誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d后，ALP染色陽性，呈現(xiàn)大量的鈣化結(jié)節(jié)，其誘導(dǎo)結(jié)果顯著優(yōu)于其他化學(xué)藥物誘導(dǎo)組，是樹鼩BM-MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的最適合的化學(xué)藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)液。細(xì)胞因子方面，50ng/m L的BMP-2即可成功將樹鼩BM-MSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，BMP-2濃度過高并不見得具有更佳的誘導(dǎo)作用。A組化學(xué)藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)液與B組（50ng/m L的BMP-2）細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)液兩者間的誘導(dǎo)結(jié)果并無顯著差異，值得一提的是，D組培養(yǎng)液結(jié)合維生素C、β-磷酸甘油鈉及 BMP-2兩種不同類型的誘導(dǎo)物，并沒有呈現(xiàn)更佳的誘導(dǎo)結(jié)果，出現(xiàn)這種情況也許與兩者的濃度配比有關(guān)，也不排除是由于缺少地塞米松的刺激，也有可能是這兩種不同類型的誘導(dǎo)物有拮抗作用，具體原因仍需要相關(guān)實驗驗證。

本研究通過對比不同誘導(dǎo)條件對樹鼩BMMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響，探討最適配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)液配方，實驗結(jié)果為樹鼩BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)研究提供了一定的指導(dǎo)依據(jù)，為開發(fā)針對樹鼩BM-MSCs的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)及鑒定的試劑盒提供實驗依據(jù)，也為樹鼩BM-MSCs應(yīng)用于人類相關(guān)疾病研究奠定了基礎(chǔ)[14]。