束縛應(yīng)激致福利損傷小鼠肝臟中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)*

馬 暢 趙迎峰 梁 磊 尤金煒 董 敏 惲?xí)r鋒

（1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國(guó)科普教育基地，南京 210002）（2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部保健科，南京 210002）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究和發(fā)展的重要支撐條件，其福利水平對(duì)科學(xué)研究有著重要的影響。福利受損使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能實(shí)現(xiàn)康樂(lè)狀態(tài)（well-being）[1]，其生存質(zhì)量下降、機(jī)體各系統(tǒng)紊亂，這將會(huì)降低研究結(jié)果的可靠性[2-3]。束縛應(yīng)激導(dǎo)致的生理變化是一個(gè)復(fù)雜的生理調(diào)控過(guò)程，最終導(dǎo)致體外表征的出現(xiàn)，這一過(guò)程必然是由多種調(diào)控蛋白參與其中。鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，廣泛表達(dá)于多種真核細(xì)胞中，作為 Ca2+的受體蛋白，其對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴的細(xì)胞功能和酶系統(tǒng)都有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的ICR小鼠，通過(guò)束縛應(yīng)激以降低其福利水平，觀測(cè)其肝組織中CaM表達(dá)水平的變化，探尋實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與CaM之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼育環(huán)境

SPF級(jí)雄性 ICR小鼠20只，3周齡，18～19 g，由南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供 SCXK（軍）2012-0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為 SYXK（軍）2012-0047。全價(jià)顆粒飼料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和慢性束縛應(yīng)激模型建立

20只ICR小鼠隨機(jī)挑選并分組：對(duì)照組（n=10）：常規(guī)飼養(yǎng)；束縛組（n=10）：參照文獻(xiàn)[5]，使小鼠保定于束縛器內(nèi)（限制其自由活動(dòng)，但無(wú)壓迫感），實(shí)驗(yàn)期每日8：00、15：00 開(kāi)始，每次束縛 1 h，期間禁食禁水，干預(yù)期一周。

1.3 試劑及儀器

RIPA蛋白裂解液（碧云天），一抗 CaM antibody、CaMKⅡantibody、GAPDH antibody（Santa Cruze），二抗山羊抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP（Santa Cruze），Protein Marker、BCA Protein Assay Kit（Takara），Acr、Bis、Tris（Sigma），ELISA試劑盒（Ray Biotech）。 垂直電泳系統(tǒng)、酶標(biāo)儀（Bio-red），5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tannon），7600全自動(dòng)生化分析儀（日立）。

1.4 樣本采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 記錄小鼠的初始、終末體質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)食量，計(jì)算體增重和飼料能效比。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)期結(jié)束，小鼠經(jīng)眼眶靜脈叢收集血液樣品，室溫下靜置 1 h，5 000 r/m in離心 15 m in，分離血清，-40℃冰箱保存。ELISA試劑盒檢測(cè)皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)主要肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶。

1.4.3 Western blot檢測(cè)CaM、CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平：取各組小鼠肝臟組織約100 mg，加預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液1 m L，冰浴勻漿，13 000 r/min低溫離心，BCA Protein Assay Kit測(cè)定上清液的總蛋白濃度。各組蛋白上樣量為40μg，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，PBST配制10%脫脂牛奶用于封閉，適當(dāng)比例稀釋的 CaM、CaMKⅡ和GAPDH一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜，相應(yīng)二抗37℃孵育30 min，洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，應(yīng)用Tannon化學(xué)發(fā)光圖像分析儀拍照分析，每組樣本進(jìn)行3次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體增重與飼料能效比

見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)為期一周的束縛應(yīng)激后，束縛組小鼠體增重較對(duì)照組顯著減少（P＜0.01），飼料能效比顯著降低（P＜0.01）。

表1 體增重與飼料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

表1 體增重與飼料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01Note： Compare with untreated group， **P＜0.01.

對(duì)照組10.10±1.45 20.37±1.88束縛組 6.06±1.87** 14.86±3.73**

2.2 免疫功能和神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)

見(jiàn)表2。束縛應(yīng)激后小鼠的脾臟和胸腺的臟器指數(shù)較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），而血清中的皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

表2 免疫學(xué)指標(biāo)與血清 CORT、ACTH的測(cè)定結(jié)果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

表2 免疫學(xué)指標(biāo)與血清 CORT、ACTH的測(cè)定結(jié)果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compare with untreated group，*P＜0.05，**P＜0.01

0.6628±0.1006 0.2703±0.0415 68.95±8.14 7.61±1.07束縛組 0.5097±0.1198** 0.2514±0.0212* 106.96±9.38** 8.34±1.15對(duì)照組*

2.3 主要肝功能指標(biāo)

見(jiàn)表3。束縛應(yīng)激后小鼠的主要肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。

表3 主要肝功能測(cè)定結(jié)果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

表3 主要肝功能測(cè)定結(jié)果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05Note： Compare with untreated group， *P＜0.05

組別 谷草轉(zhuǎn)氨酶AST/（U/L）谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT/（U/L）堿性磷酸酶ALP/（IU/L）127.23±29.89 72.52±16.39 112.31±22.78束縛組 161.66±32.87*106.44±24.11* 145.39±25.91對(duì)照組*

2.4 CaM、CaM KⅡ蛋白表達(dá)

與對(duì)照相比，束縛組小鼠肝臟中CaM和CaMKⅡ相對(duì)表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.05），如圖1。

3 討論

圖1 各組小鼠肝臟CaM、CaM KⅡ蛋白表達(dá)Fig.1 Relative exp ression of CaM、CaM KⅡin liver of different groups

科研工作中各種操作給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來(lái)的心理和生理痛苦是常見(jiàn)的福利傷害[6]，正確評(píng)估并加以改善福利傷害是動(dòng)物福利的主要研究方向。束縛應(yīng)激是目前常用的一種引發(fā)身心壓力造成福利損害的實(shí)驗(yàn)方法[7]。本實(shí)驗(yàn)選取較為公認(rèn)的動(dòng)物福利評(píng)價(jià)指標(biāo)[8]，綜合評(píng)價(jià)束縛應(yīng)激對(duì)小鼠福利的傷害情況。本實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)指標(biāo)顯示，束縛應(yīng)激后小鼠的體增重和FER均顯著下降，提示束縛應(yīng)激使小鼠生長(zhǎng)速度減緩。有研究報(bào)道，實(shí)驗(yàn)操作能使小鼠免疫器官退化，導(dǎo)致免疫抑制[9]，本實(shí)驗(yàn)也得到相同結(jié)論，主要免疫器官臟器指數(shù)結(jié)果顯示，束縛組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低，說(shuō)明束縛應(yīng)激可影響小鼠的免疫器官。據(jù)以往報(bào)道，機(jī)體受應(yīng)激刺激后以下丘腦-垂體-腎上腺通路（HPA）激活為主要特征，而HPA終末產(chǎn)物皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平上調(diào)是其激活的主要表現(xiàn)[10]。本研究的結(jié)果表明，束縛組外周血清的皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平明顯升高，表明應(yīng)激小鼠 HPA軸的激活，改變了其體內(nèi)相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)活性。綜上指標(biāo)，我們可以認(rèn)為束縛組小鼠已經(jīng)福利受損。

肝臟作為一種重要的代謝器官，應(yīng)激會(huì)影響肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)果。有研究報(bào)道情緒應(yīng)激能顯著增大肝臟的血流量[11]。另有研究表明，酒精性肝炎患者的心理應(yīng)激水平和肝纖維化程度密切相關(guān)[12]。Kunkel等研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型病毒性肝炎患者血清ALT水平與心理抑郁程度之間有顯著的正相關(guān)系[13]。在動(dòng)物模型研究中，應(yīng)激和肝病之間的密切關(guān)系也已得到證實(shí)。Iwai等[14]報(bào)道電擊應(yīng)激可以加重用四氯化碳處理過(guò)的小鼠肝臟損害。而在正常的嚙齒類動(dòng)物中，束縛或電擊應(yīng)激可導(dǎo)致輕度肝損傷，其特點(diǎn)是血清中 ALT水平輕度升高[15-16]。本研究結(jié)果顯示，束縛應(yīng)激組小鼠的 AST、ALT和ALP三項(xiàng)肝功能指標(biāo)均顯著升高，表明束縛應(yīng)激致福利損傷小鼠的肝功能已經(jīng)受到損害，而且持續(xù)慢性應(yīng)激可以維持這種損傷程度，正如Zhu等[17]的研究結(jié)果，慢性束縛應(yīng)激損害了肝臟的功能。

束縛應(yīng)激導(dǎo)致的生理變化是一個(gè)復(fù)雜的生理調(diào)控過(guò)程，最終導(dǎo)致體外表征的出現(xiàn)，例如當(dāng)福利水平下降時(shí)，動(dòng)物往往表現(xiàn)出毛色不順、攝食減少、免疫抑制、代謝及內(nèi)分泌紊亂等一系列問(wèn)題，這一過(guò)程必然是由多種調(diào)控蛋白/因子參與其中。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，制動(dòng)使SD大鼠福利受損時(shí)，其肝臟中核因子-κB的蛋白和基因水平均顯著升高，預(yù)示著核因子-κB的變化參與了福利損傷及機(jī)體功能紊亂的調(diào)控[18]。在真核生物中，CaM作為胞質(zhì)溶膠蛋白可調(diào)節(jié)多種Ca2+依賴的功能和酶活性。Ca2+-CaM信號(hào)在許多病理生理過(guò)程中起著重要的作用。鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）為廣泛分布的多功能蛋白激酶，參與多種生理和病理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，也是影響胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的最重要因素之一[19-20]。為了進(jìn)一步探究機(jī)體內(nèi)參與應(yīng)激致福利損傷的信號(hào)分子通路，本研究對(duì)肝臟組織CaM和CaMKⅡ的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示束縛應(yīng)激條件下的這兩種蛋白水平均顯著升高，因此我們推測(cè)束縛應(yīng)激至機(jī)體產(chǎn)生終末代謝物的這一個(gè)過(guò)程，CaM及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白參與其中，但 CaM和CaMKⅡ在這一過(guò)程中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確，需要我們進(jìn)一步探索。