諾麗果發(fā)酵液抑制肝癌細(xì)胞Bel7402增殖及促凋亡作用觀察

范海能，蘇定志，王謙，馮華諾，張叢，魯琰，吳英日*

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)三亞療養(yǎng)院，海南 三亞 572000；2.海南省衛(wèi)生學(xué)校，海南 ?？?570311；3.海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199)

諾麗(Noni)，學(xué)名Morinda citrifolia，又稱海濱木巴戟、海巴戟天、諾尼，屬茜草科巴戟天屬植物，諾麗主要生長(zhǎng)在南太平洋群島，在我國(guó)主要分布在臺(tái)灣、海南及西沙群島等地。

諾麗果在波利尼西亞地區(qū)已有兩千多年的歷史，目前在國(guó)外已是一種常見(jiàn)的食物。有研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，諾麗果富含20多種氨基酸、維生素C、多糖、環(huán)烯醚萜、蒽醌類等多種有效成分，具有體外抗腫瘤、抗氧化、抑菌消炎等活性[4];諾麗葉含有黃酮、皂甙、多糖等活性成分，種子含有甾醇類、東莨菪亭[5-6]等活性成分。目前，諾麗果已被應(yīng)用于許多領(lǐng)域。例如：抗癌、抗炎、抗氧化以及保護(hù)人體器官等[7-9]。

肝癌(HCC)是全球第五大癌癥，而其死亡率卻居全球第三。其中50%以上的肝癌患者分布在中國(guó)內(nèi)地[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年死于肝病的人數(shù)是30萬(wàn)，其中約有11萬(wàn)人死于肝癌[11]，肝癌已經(jīng)成為我國(guó)嚴(yán)重的健康問(wèn)題。所以尋找肝癌特效的治療藥物成為了亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著世界范圍內(nèi)“回歸自然”浪潮的涌起，人們開(kāi)始將新藥研發(fā)的目光轉(zhuǎn)向天然抗腫瘤藥物上，特別是一些天然抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)，極大地鼓舞了科學(xué)家們從天然產(chǎn)物中創(chuàng)制抗腫瘤新藥的信心。

作為一種廣為流傳的藥用植物,諾麗果已經(jīng)被應(yīng)用于治療流感、糖尿病、高血壓、腫瘤等[12-16]。但是關(guān)于諾麗果對(duì)肝癌的影響等方面的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道，那么它對(duì)肝癌的增殖和凋亡是否有影響呢？以及其具體的分子機(jī)制又是如何呢？這引起了我們極大地興趣。所以本研究在體外用諾麗果發(fā)酵液處理肝癌Bel7402細(xì)胞，探討諾麗果發(fā)酵液對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡情況的影響。為下一步研究諾麗果發(fā)酵液組份對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

超凈工作臺(tái)(上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海迅能電熱設(shè)備有限公司);發(fā)酵罐(溫州市億一機(jī)械有限公司);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)iMark);流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

胎牛血清(批號(hào):13011-8611)購(gòu)自杭州四季青生物公司;DMEM培養(yǎng)液(批號(hào):12100)、MTT試劑盒(批號(hào):M1020)購(gòu)自索萊寶生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(批號(hào):A100231 )購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):C1062)、DAPI染色液(批號(hào):C1005)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;人肝癌細(xì)胞 Bel7402細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 諾麗果發(fā)酵液的制備

取5 kg新鮮成熟的諾麗果于發(fā)酵罐中，密封室溫自然發(fā)酵40 d取汁，過(guò)濾取清液，最后用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后-20℃保存待用，參照文獻(xiàn)[2,17]，在臨用前用培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵液。取7.5 mL發(fā)酵原液加入細(xì)胞培養(yǎng)基定容到10 mL即為75%的發(fā)酵液，取5 mL發(fā)酵原液加入細(xì)胞培養(yǎng)基定容到10 mL即為50%的發(fā)酵液。發(fā)酵液原液即為100%的發(fā)酵液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞Bel7402培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 MTT測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞Bel7402，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105/mL，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞貼壁?？瞻讓?duì)照組加入20 μL DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入20 μL濃度分別為50%、75%、100%的諾麗果發(fā)酵液藥液，每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。藥物作用24 h、48 h后，每孔加入濃度為 5 g/L 的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按照公式

1.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞Bel7402，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)過(guò)夜待細(xì)胞貼壁。然后將培養(yǎng)液加入400 μL不同濃度的諾麗果發(fā)酵液，藥物作用72 h后，收集全部細(xì)胞，PBS洗滌2次，先加入400 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入Annexin V-FITC和PI各10 μL，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

1.6 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將Bel7402細(xì)胞按1×105個(gè)每孔的密度接種于預(yù)先放有蓋玻片的24孔板中，每孔1 mL培養(yǎng)基，分為2組，每組3個(gè)孔。培養(yǎng)24 h后，向孔中加入200 μL諾麗果發(fā)酵液原液。培養(yǎng)48 h，取出蓋玻片，PBS反復(fù)洗滌3次，再加入0.5 mL固定液固定2 h，PBS繼續(xù)洗滌2次。再加入0.5 mL DAPI染色液，染色15 min。倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞核形態(tài)并拍照記錄。

1.7 Western blotting檢測(cè)Survivin基因的表達(dá)

將Bel7402細(xì)胞按1×105個(gè)每孔的密度接種于24孔板中，每孔1 mL培養(yǎng)基，分為2組，每組3個(gè)孔。培養(yǎng)24 h后，向?qū)嶒?yàn)組各孔中加入200 μL諾麗果發(fā)酵液原液。培養(yǎng)48 h后加入100 μL蛋白裂解液4℃裂解30 min，12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍准尤肷蠘泳彌_液后100℃變性10 min。取50 μg樣品總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入1∶1 000稀釋的Survivin單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后再加入羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗果發(fā)酵液對(duì)Bel7402增殖的抑制作用

MTT結(jié)果顯示,濃度為50%、75%、100%的諾麗果發(fā)酵液藥液作用于肝癌細(xì)胞Bel7402后肝癌細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，且抑制效率呈明顯的劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)表1)。這說(shuō)明諾麗果發(fā)酵液在體外能夠抑制肝癌Bel7402細(xì)胞的增殖。

表1 諾麗果發(fā)酵液對(duì)Bel7402增殖的抑制率

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

圖1a是流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡情況，其中每張圖的左下象限代表正常細(xì)胞群，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞群。圖1b是由細(xì)胞凋亡比例生成的數(shù)據(jù)直方圖，從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組凋亡率顯著升高，同時(shí)諾麗果發(fā)酵液作用Bel7402細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比例隨著發(fā)酵液濃度的升高細(xì)胞凋亡率也出現(xiàn)了明顯的上升趨勢(shì)。這說(shuō)明諾麗果發(fā)酵液在體外能誘導(dǎo)肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞凋亡率與發(fā)酵液濃度密切相關(guān)。

注：A.對(duì)照組肝癌細(xì)胞;B.經(jīng)濃度為50%的發(fā)酵液處理過(guò)的肝癌細(xì)胞;C.經(jīng)濃度為75%的發(fā)酵液處理過(guò)的肝癌細(xì)胞;D經(jīng)濃度為100%的發(fā)酵液處理過(guò)的肝癌細(xì)胞;與空白對(duì)照組比較，*P<0.05圖1 諾麗果發(fā)酵液對(duì)Bel7402細(xì)胞凋亡情況的影響

2.3 DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，呈多角形(圖2A)；而被諾麗果發(fā)酵原液(100%發(fā)酵液)處理48 h后，細(xì)胞貼壁數(shù)量較少，形態(tài)明顯變圓，出現(xiàn)細(xì)胞破碎等損傷現(xiàn)象(圖2B)。在熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)正常，顯藍(lán)色熒光，核輪廓清晰，呈橢圓形(圖2C)；而給藥組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，細(xì)胞核碎裂，可見(jiàn)凋亡小體(圖2D)。

注：A-D分別代表白光下對(duì)照組細(xì)胞、發(fā)酵液處理組細(xì)胞、熒光下對(duì)照組細(xì)胞核情況以及發(fā)酵液處理組細(xì)胞核情況圖2 DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

2.4 Western blotting檢測(cè)Survivin基因表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示諾麗果發(fā)酵液原液(100%發(fā)酵液)處理肝癌細(xì)胞Bel7402 48 h后細(xì)胞的抗凋亡基因Survivin的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低(見(jiàn)圖3)。

注：A.對(duì)照組;B.發(fā)酵液處理組圖3 Western blotting分析諾麗果發(fā)酵液對(duì)Survivin基因表達(dá)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

肝癌是世界上常見(jiàn)的五大惡性腫瘤之一，它的發(fā)生和發(fā)展不僅與肝癌細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，還與肝癌細(xì)胞凋亡的減少密切相關(guān)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前腫瘤藥物治療的主要策略[15]。

諾麗果作為一種廣為流傳的藥用植物已經(jīng)被應(yīng)用于治療流感、糖尿病、高血壓等。這些功能都被傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代科學(xué)研究所證實(shí)。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]諾麗果提取物能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。但是關(guān)于諾麗果發(fā)酵液對(duì)肝癌的影響等方面的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文選擇抗菌抗炎癥反應(yīng)效果最顯著的諾麗果發(fā)酵液[16-18]在體外處理肝癌Bel7402細(xì)胞，利用MTT法測(cè)定不同濃度諾麗果發(fā)酵液對(duì)Bel7402細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞分析以及DAPI染色法檢測(cè)諾麗果發(fā)酵液作用后的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)諾麗果發(fā)酵液能顯著抑制肝癌細(xì)胞Bel7402的增殖，流式細(xì)胞分析以及DAPI染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)諾麗果發(fā)酵液作用Bel7402細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比例顯著增多且成濃度依賴性。這說(shuō)明諾麗果發(fā)酵液在體外能抑制肝癌Bel7402細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一員，在癌組織中表達(dá)水平顯著升高。Survivin能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，是非常強(qiáng)大的凋亡抑制因子[19]。本實(shí)驗(yàn)利用Western blotting技術(shù)分析了諾麗果發(fā)酵液對(duì)肝癌細(xì)胞抗凋亡基因Survivin 表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)諾麗果發(fā)酵液原液處理肝癌細(xì)胞Bel7402后，細(xì)胞的survivin基因表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低，這說(shuō)明諾麗果發(fā)酵液在體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是抑制了Survivin基因的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步研究諾麗果發(fā)酵液組份對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制等奠定良好的基礎(chǔ)。目前本研究只涉及體外諾麗果抗腫瘤作用的藥效學(xué)研究，對(duì)于其抗肝癌的分子機(jī)制和作用機(jī)理以及運(yùn)用現(xiàn)代藥理學(xué)分析方法開(kāi)展體內(nèi)水平的研究將是我們下一步工作的方向。這些研究將逐步闡明諾麗果抗腫瘤的分子機(jī)制，將對(duì)這些天然抗腫瘤藥物從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用起到積極的推動(dòng)作用。