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    用于軟骨缺損修復(fù)的殼聚糖水凝膠降解性能的表征*

    2018-12-29 02:57:56朱飛燕朱天飛梁仟譚回熊建義
    關(guān)鍵詞:將水濾紙皮下

    朱飛燕朱天飛梁仟譚回熊建義**

    (1.中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,廣州510275;2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳518035;3.深圳市第二人民醫(yī)院深圳神經(jīng)外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,廣東深圳518035)

    目前,創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損及骨組織損傷患者日益增多,特別是關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損占很大比例[1]。軟骨是一種高度分化的結(jié)締組織,由于其無血管和淋巴管,其營(yíng)養(yǎng)液主要來自滑液和軟骨下血管,尤以前者為主要來源,且軟骨細(xì)胞埋于稠厚的細(xì)胞外環(huán)境中,缺乏遷徙能力,自愈能力有限,因此其缺損修復(fù)能力非常有限,軟骨缺損修復(fù)仍然是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題[2]。

    近年來,軟骨組織工程的興起和發(fā)展為治療軟骨缺損疾病帶來了新的希望[3,4]。軟骨組織工程的一大重要因素即支架材料,支架材料必須能夠很好的模擬細(xì)胞外環(huán)境,并且是生物可降解或可吸收的材料。尋找合適的細(xì)胞支架材料所面臨的最大挑戰(zhàn)就是人體組織的復(fù)雜性。水凝膠中含有大量的水分,由于其柔軟,可以形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),具有很好的生物相容性,是細(xì)胞外基質(zhì)的理想替代材料,并具有生物粘附性以及生物可降解性[1]。水凝膠的溶脹性、響應(yīng)性、多孔結(jié)構(gòu)利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送以及代謝產(chǎn)物的輸出等優(yōu)良的性質(zhì)使其成為組織工程支架材料的理想選擇[5]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的軟骨修復(fù)的水凝膠主要有瓊脂類[6,7]、海藻酸類[8]、纖維蛋白類[6,9]、聚乙二醇類(poly ethylene glycol,PEG)[10]、透 明質(zhì)酸 類(hyaluronic acid,HA)[11]以及殼聚糖類[12,13]等。目前,殼聚糖水凝膠用于軟骨缺損修復(fù)被廣受關(guān)注,因?yàn)闅ぞ厶蔷哂衅咸烟前芬约癗-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)與軟骨中的粘多糖成分相似,可以進(jìn)一步促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)[14]。

    將水凝膠作為支架材料用于軟骨缺損修復(fù)的研究很多,但很少關(guān)注支架材料的體內(nèi)外降解。本研究采用羥乙基脫乙酰殼多糖(glycol chitosan,GC)與二醛基聚乙二醇(OHC-PEG-CHO)通過席夫堿反應(yīng)交聯(lián)而形成水凝膠。該水凝膠成膠條件溫和,成膠時(shí)間可控,具有良好的生物相容性,并且具有可注射性,是一種理想的軟骨組織工程支架材料。本文以該水凝膠為例研究了水凝膠在體外以及動(dòng)物皮下的降解情況,為水凝膠作為軟骨缺損修復(fù)支架材料的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及試劑

    GC,PEG(分子量2 kDa,由美國(guó) Sigma公司提供);磷酸緩沖鹽(PBS)(由美國(guó)Gibco公司提供);二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC),4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)(由北京百靈威試劑公司提供)。

    1.2 OHC-PEG-CHO 的合成[15,16]

    OHC-PEG-CHO的合成過程與文獻(xiàn)報(bào)道的類似:對(duì)甲酰苯甲酸(2.4 g,16 mol),DCC(3.3 g,16 mmol),DMAP(0.366 g,2 mmol)溶于適量的CH2Cl2,混合均勻后轉(zhuǎn)移到250 ml的單口燒瓶中,放置37℃水浴中攪拌,然后加入 PEG(4 g,2 mmol)的 CH2Cl2溶液,共用CH2Cl2200 ml。反應(yīng)24 h后將反應(yīng)物過濾,將濾液濃縮后加入異丙醇,70℃溶解后,-20℃冷卻重結(jié)晶后迅速過濾。將過濾的固體水洗離心(10000 rpm,10 min)4次后凍干,得到產(chǎn)物OHC-PEG-CHO,產(chǎn)率為80%。

    1.3 水凝膠的制備

    GC與OHC-PEG-CHO均在紫外燈下照射1 h進(jìn)行滅菌。水凝膠(GC/OHC-PEG-CHO:2 wt%/2 wt%)的制備:用PBS配置250 μl GC溶液(4%w/v)與250 μl的OHC-PEG-CHO溶液(4%w/v),混合溶液加入模具中,5 min內(nèi)形成水凝膠。

    水凝膠(GC/OHC-PEG-CHO:2 wt%/1 wt%)的制備:將250 μl的GC溶液(4%w/v)與250 μl的OHCPEG-CHO溶液(2%w/v),混合溶液加入模具中,5 min內(nèi)形成水凝膠。

    1.4 水凝膠的體外降解實(shí)驗(yàn)

    將0.5 ml不同濃度的水凝膠(GC/OHC-PEGCHO:2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%)制備完成后,分別裝入25 ml無菌PBS的樣品瓶中,樣品瓶使用高壓蒸汽(121℃,30 min)提前滅菌。將樣品瓶置于搖床(25℃,100 rpm)中進(jìn)行震蕩,定期取出水凝膠,測(cè)定pH值、重量和體積變化。①pH值的測(cè)定:將水凝膠從降解液取出后,用已校準(zhǔn)的pH計(jì)測(cè)定。②重量變化的測(cè)定:將水凝膠從降解液中取出放在濾紙上,用濾紙輕輕擦拭,直至濾紙上無明顯的水痕后稱重。水凝膠的質(zhì)量即某個(gè)時(shí)間點(diǎn)水凝膠的重量占初始重量的百分比。每組水凝膠的質(zhì)量測(cè)定為3個(gè)樣品,每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。③體積變化的測(cè)定:水凝膠制備的過程使用圓柱形的模具。水凝膠的體積測(cè)定是將水凝膠從降解液中取出放在濾紙上,用濾紙輕輕擦拭,直至濾紙上無明顯的水痕后,用游標(biāo)卡尺測(cè)出水凝膠的高和直徑,從而計(jì)算出水凝膠的體積。水凝膠的體積即某個(gè)時(shí)間點(diǎn)水凝膠的體積占初始體積的百分比。每組水凝膠的體積測(cè)定為3個(gè)樣品,每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

    1.5 水凝膠的皮下降解實(shí)驗(yàn)

    新西蘭兔,雄性、8周齡、體重2.5~3.0 kg(由北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供),在正常條件下飼養(yǎng),自由進(jìn)取食物和水。動(dòng)物的照料及處理均參照深圳市第二人民醫(yī)院關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和照料指導(dǎo)規(guī)則。新西蘭兔使用戊巴比妥鈉(3%)腹腔注射麻醉后,剃除背部毛后用碘伏消毒,手術(shù)剪剪出長(zhǎng)度為10 mm的傷口。在皮膚下埋入0.5 ml的無菌水凝膠(GC/OHC-PEG-CHO:2 wt%/2 wt%)。傷口用手術(shù)線縫合。定期取出新西蘭兔背部水凝膠,10%的福爾馬林固定,石蠟包埋,切出4 μm的薄片后HE染色觀察。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用Origin 9(Origin Lab Lnc,USA)軟件對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,獲得的數(shù)據(jù)通過軟件求平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。

    2 結(jié)果

    2.1 水凝膠降解過程中pH變化表征

    比較不同濃度的水凝膠(GC/OHC-PEG-CHO:2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%)在體外降解的降解液的pH值。如圖1所示,兩種濃度的水凝膠在體外降解的過程中pH基本維持中性,不會(huì)產(chǎn)生酸性或堿性的降解產(chǎn)物,這有利于將水凝膠應(yīng)用于軟骨缺損修復(fù)。

    圖1 水凝膠體外降解的pH變化圖

    2.2 水凝膠降解過程中質(zhì)量和體積變化表征

    如圖2和圖3所示,水凝膠(GC/OHC-PEGCHO:2 wt%/1 wt%)在6周時(shí)全部降解,而水凝膠(GC/OHC-PEG-CHO:2 wt%/2 wt%)在8周時(shí)質(zhì)量為初始質(zhì)量的(44.30±5.51)%,8周時(shí)體積為初始體積的(50.64±9.81)%,該降解速度與軟骨修復(fù)速率一致。

    圖2 水凝膠體外降解的質(zhì)量變化圖

    圖3 水凝膠體外降解的體積變化圖

    因此,水凝膠的降解速率與組分的濃度有關(guān),濃度越大,水凝膠的降解時(shí)間越長(zhǎng)??赡苁请S著水凝膠組分濃度的增加,水凝膠的交聯(lián)度增加,降解時(shí)間變長(zhǎng)。

    2.3 水凝膠降解過程中相容性表征

    根據(jù)以上測(cè)試結(jié)果,我們選取水凝膠(GC/OHCPEG-CHO:2 wt%/2 wt%)繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)相容性的測(cè)試。動(dòng)物的皮下植入實(shí)驗(yàn)可考察材料在降解過程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)等,為材料的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。水凝膠植入3周后的體積明顯減小,同時(shí)水凝膠的表面已附上動(dòng)物的組織(圖4)。由此可見,水凝膠在降解的過程中,與動(dòng)物的相容性很好。將體內(nèi)取出的水凝膠進(jìn)行HE染色分析示水凝膠在皮下組織中無明顯的炎癥反應(yīng)(圖5)。

    圖4 水凝膠植入前的初始狀態(tài)(A)和皮下植入3周后取出的狀態(tài)(B)

    圖5 水凝膠皮下植入3周后取出的HE染色(A、B)

    3 討論

    本研究考察了GC/OHC-PEG-CHO水凝膠的降解性能,降解實(shí)驗(yàn)表明其降解速率與分組濃度有關(guān)??赏ㄟ^調(diào)節(jié)水凝膠成分的濃度來調(diào)控水凝膠的降解時(shí)間。將水凝膠植入動(dòng)物皮下的實(shí)驗(yàn)表明,水凝膠的相容性較好,與動(dòng)物組織無明顯的炎癥反應(yīng)。因此,GC/OHC-PEG-CHO水凝膠可作為一種優(yōu)良的軟骨組織工程支架材料的選擇。后續(xù),仍需將該水凝膠進(jìn)行軟骨修復(fù)的性能表征研究,以期為臨床的軟骨組織工程提供一種理想的支架材料。

    綜上,降解性能的測(cè)試表明水凝膠的降解時(shí)間與水凝膠組分的濃度有關(guān),水凝膠的組分濃度越大,水凝膠的降解時(shí)間越長(zhǎng)。動(dòng)物的皮下植入測(cè)試表明水凝膠植入后,與組織無明顯的炎癥反應(yīng),具有良好的生物相容性。因此,GC/OHC-PEG-CHO水凝膠可作為一種軟骨組織工程支架材料的備選。

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