以腦內神經遞質失衡為特征的抑郁癥大鼠模型的改良研究

王東輝 潘彥舒 郭洋洋 郭 婕 程曉娜 韓振蘊

(北京中醫(yī)藥大學，北京，100029)

在前期的臨床觀察中，本團隊發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦內的單胺類神經遞質存在含量失衡的情況，表現(xiàn)為5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)↑、多巴胺(Dopamine,DA)↓，乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)↑、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)↓[1]。據此臨床現(xiàn)象，本團隊建立了以腦內神質失衡為特征的抑郁癥大鼠模型[2]。原造模方法需要安裝套管用以向左側海馬給藥。套管安裝后，注射多巴胺D1受體抑制劑SCH23390，以打破雙側海馬和大腦皮質內神經遞質含量的平衡，藥物的劑量為2 μg/μL×1 μL/d，每注射2 d，休息1 d，反復3次，共計給藥6次。然而，安裝給藥用套管會增加造模時間，且不利于強迫游泳實驗和水迷宮等實驗的開展。所以，本實驗希望去除套管的安裝，提高給藥劑量，減少給藥次數(shù)，以優(yōu)化造模過程，并觀察改良模型的有效性和病理特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠26只，體重250～270 g，購買自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK(京)2014-0004]。飼養(yǎng)條件為：溫度(22±1)℃；濕度(47±2)%；12 h晝夜交替光照，自由進食進水。

1.1.2 試劑及儀器 SCH23390(Sigma，批號：125M4614V)，5-HT(上海阿拉丁，批號：S111161)，DA(上海阿拉丁，批號：D103111)，NE(上海阿拉丁，批號：D134211)，5-HIAA(上海阿拉丁，批號：H133485)。

68003型腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，78001型顱骨鉆(瑞沃德生命科技有限公司，深圳)，API3200型液質聯(lián)用儀(Applied Biosystems)，UltiMate3000型高效液相色譜儀(Dionex)，MULTISKANMK3型全自動多功能酶標儀(Thermo)

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 大鼠采用單籠飼養(yǎng) 適應性飼養(yǎng)1周后，根據糖水消耗實驗情況，將健康大鼠隨機分組：正常對照組9只、原模型組11只、改良模型組11只。

1.2.1.2 模型的制備 第1次給藥時用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,ip，后3次給藥以乙醚吸入麻醉。將麻醉好的大鼠放置于帶有微量注射器的腦立體定位儀上，依據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜所示[3]，定位大鼠左半側海馬(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm)。使用顱骨鉆在顱骨相應位置打孔，緩慢將微量注射器插入所需深度，注射SCH23390，劑量為8 μg/μL×1 μL/d，隔1 d給藥1次，共給藥4次。

1.2.1.3 原模型制備 1)安裝給藥用套管：原模型組以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,腹膜內給藥，將麻醉好的大鼠放置于腦立體定位儀上，依據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，定位左側海馬(AP-3 mm,L 1.8 mm,H 3 mm),使用顱骨鉆在顱骨相應位置打孔，植入一微量注射用套管(直徑0.56 mm，長度3.2 mm)和2枚配套螺絲，用牙托水、牙托粉固定。術后大鼠自由飲水飲食，連續(xù)3 d青霉素2×104單位,腹膜內給藥，恢復1周后給藥；2)給藥：大鼠吸入乙醚麻醉，使用微量注射器，通過套管向海馬注射SCH23390，劑量為2 μg/μL×1 μL，每給藥2 d，休息1 d，共給藥6 d。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 體重及行為學測試 正常對照組不做處理，給藥后兩周進行體重及行為學測試。1)體重測定：于成模后第14天進行體重測定；2)糖水消耗實驗：依據文獻[4]并加以調整，于成模后第14天進行糖水消耗實驗，配制1%的蔗糖水，每只大鼠第1天給予2瓶蔗糖水，第2天給予1瓶蔗糖水和1瓶大鼠飲用水，第3天禁食禁水24 h，24 h后將1瓶重200 g的1%蔗糖水和1瓶重200 g的飲用水給予每只大鼠。于12 h后取走2種液體，并稱量每瓶液體所剩質量，依據公式糖水偏愛率(%)=糖水消耗/總液體消耗×100%，求得每只大鼠的糖水偏愛率。3)曠場實驗[5]：依據文獻并加以調整，于成模后第14天進行，自制1個100 cm×100 cm×40 cm木箱，黑色，有底無蓋，用白線將底部均勻劃成5×5個方格。在安靜、光線昏暗的環(huán)境下，將大鼠從同一位置、同一方向放置于木箱的中央，大鼠自由活動。計算5 min內大鼠活動的水平運動得分(大鼠四肢均穿過的方格數(shù)，若沿線行走，則以20 cm為1格)和垂直運動得分(兩前肢完全抬離地面至少1 cm或攀爬箱壁至放下的次數(shù))。在2只大鼠測試間歇，使用低濃度乙醇溶液擦拭敞箱，以防止上一只大鼠所留氣味對其后大鼠的實驗結果產生影響。

1.2.2.2 病理學檢測 1)取材：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，斷頭后，取出腦組織，分離大腦皮質及左、右海馬，裝入離心管中，放于-20 ℃冰箱中備用。2)HLPC-MS測量皮層、左右海馬中5-HT、DA、NE、5-HIAA含量：取組織，滴下生理鹽水，勻漿。取勻漿液50 μL，加入含有內標異丙腎上腺素的甲醇200 μL，斡旋1 min后，13 000 r/min離心4 min，保證溫度在4 ℃作用。取上清液，備用。色譜條件：流動相：A水相：水(0.1%甲酸)，B有機相：乙腈(0.1%甲酸)，色譜柱：MSLab C18(150×4.6 mm 5 μm)，柱溫：50 ℃。進樣量為10 μL，流速為1 mL/min。質譜條件：離子源，采用+ESI電噴霧離子源；噴霧電壓為4 800 V；霧化氣為50 psi；輔助氣為60 psi；碰撞氣為Medium；霧化溫度為500 ℃；氣簾氣為20 psi；碰撞室射入電壓:10，射出電壓:2.0，掃描方式為MRM多反應監(jiān)測。MRM(NE)=170.1/152.1，MRM(DA)154.1/137.1，MRM(5-HIAA)192.06/146.06，MRM(5-HT)=177.1/160.1，MRM(Is)=271.03/156.01。

1.2.2.3 ELISA法檢測大腦皮質及雙側海馬中AchE的含量，依據ELISA試劑盒手冊測定。

2 結果

2.1 體重及行為學測定結果 造模2周后，同正常對照組比較，改良模型組糖水偏愛率顯著降低(P<0.05)，體重、曠場運動水平和垂直運動均極顯著降低(P<0.01)。與原模型組比較，改良模型組糖水偏愛率、體重變化率、曠場試驗水平和垂直運動得分差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 左側海馬神經遞質及AchE含量 造模兩周后，同正常對照組比較，改良模型組大鼠左側海馬5-HT、NE含量極顯著升高(P<0.01)；5-HIAA含量極顯著減少(P<0.01)；DA含量呈降低趨勢，AchE含量呈升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 右側海馬神經遞質及AchE含量 造模兩周后，同正常對照組比較，改良模型組大鼠右側海馬5-HT、NE含量極顯著升高(P<0.01)；5-HIAA含量極顯著減少(P<0.01)；DA含量呈減少趨勢，AchE含量呈增加趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 大腦皮質內神經遞質及AchE含量 造模兩周后，同正常對照組比較，改良模型組大鼠大腦皮質中5-HT、NE、AchE含量呈升高趨勢；5-HIAA、DA含量呈降低趨勢(P>0.05)。見表4。

表1 各組大鼠體重及行為學變化

注：與正常對照組比較,**P<0.01;與正常對照組比較,*P<0.05

表2 左側海馬內神經遞質及AchE含量變化

注：與正常對照組比較,**P<0.01

表3 右側海馬內神經遞質及AchE含量變化

注：與正常對照組比較,**P<0.01

表4 大腦皮質內神經遞質及AchE含量變化

3 討論

抑郁癥的動物模型有許多，主要可以分為手術模型、藥物介導模型、應激模型和遺傳模型等[6]。這些模型已經被廣泛應用于抑郁癥的研究中，但每種模型都存在一定的缺陷，如：慢性輕度不可預見性應激(CUMS)模型造模時需要保障造模環(huán)境的一致性，且造模耗時長，增加了工作量；嗅球摧毀模型是創(chuàng)傷性模型，大鼠死亡率較其他模型較高，增加了實驗成本；遺傳模型不能完全模擬抑郁癥的發(fā)病過程，且應用不廣泛。因此，開發(fā)新的抑郁癥模型對抑郁癥的研究意義重大。

在之前的研究中，本團隊根據在體檢測臨床抑郁癥患者腦內神經遞質的變化規(guī)律建立了一種新的抑郁模型，該模型以腦內神經遞質失衡為主要特征，在行為學表現(xiàn)上也符合抑郁癥的特征。但是在造模過程中需要安裝套管，這延長了造模時間，且不利于水迷宮、強迫游泳實驗的進行。所以，本實驗取消了套管的安裝，提高給藥劑量、減少給藥次數(shù)，以縮短造模用時。

改良的造模方法為向左側海馬注射SCH23390，劑量為8 μg/μL×1 μL/d，給藥頻率為隔1 d給藥1次，共4次。改良模型造成的抑郁狀態(tài)依據行為學評價[7-8]?！翱旄腥笔А笔且钟舭Y的核心癥狀[9]，是指抑郁癥患者體驗快樂能力的下降。糖水消耗實驗即是評估抑郁癥動物模型的“快感缺失”情況[10]。抑郁癥患者自主活動減少，曠場實驗通過觀察動物在陌生環(huán)境下穿越格子數(shù)、抬爪次數(shù)評價動物模型自主活動和探索行為的改變。常用的抑郁模型，如CUMS模型、習得性無助模型，糖水偏愛率、曠場實驗得分均下降[11-12]。本實驗中，改良模型的體重、糖水偏愛率、曠場實驗水平及垂直運動得分均降低，表明改良的造模方法可以造成大鼠的抑郁狀態(tài)。而同原模型比較，改良模型上述指標未有明顯改變，表明改良模型、原模型所造成的抑郁程度相同。

經典的單胺遞質假說認為抑郁癥的發(fā)病與5-HT、NE、DA含量的改變有關[13]。本實驗結果顯示左、右側海馬5-HT、NE含量極顯著增加、5-HIAA含量極顯著減少，DA含量呈降低趨勢；大腦皮質內5-HT、NE含量呈增加趨勢，5-HIAA和DA含量呈降低趨勢，這與王援朝[14]的觀察結果相一致或呈現(xiàn)相應趨勢，也與原抑郁癥模型的神經遞質改變相同。

AchE是Ach的水解酶，由于Ach性質不穩(wěn)定，所以經常通過觀察AchE含量的改變反應Ach含量的變化。抑郁大鼠腦組織中AchE增加[15]，而本實驗中AchE含量呈升高趨勢，這與其他實驗結果相符合。

綜上所述，改良的造模方法能夠造成大鼠抑郁狀態(tài)，所造成的抑郁狀態(tài)與原模型相同，但因其減少了造模時間、所造模型可以用于強迫游泳實驗、或水迷宮實驗，實現(xiàn)了對原模型改良的目的。