逍遙丸指紋圖譜和摻偽檢驗方法的建立

姚立山 郝滿霞

(鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院南陽中心醫(yī)院中藥科，南陽，473009)

在國家藥品評價抽樣、常規(guī)藥材市場調(diào)研進(jìn)行薄荷藥材的抽檢考察中發(fā)現(xiàn)，薄荷存在同科的留蘭香代用或者混用的情況[1-3];逍遙丸的主要適應(yīng)證是肝郁氣滯及脾虛血虛的患者，其出處為宋代《太平惠民和劑局方》，方中以柴胡疏肝解郁，恢復(fù)肝臟條達(dá)、疏泄之性，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝濡養(yǎng)肝臟，增強(qiáng)其藏血之功；白術(shù)、茯苓健脾去濕，后天之本得以鞏固，患者神疲癥狀減輕，《靈樞·平人絕谷篇》有云：“神者，水谷之精氣也”。脾運(yùn)化有權(quán)，統(tǒng)氣血有司，脾土養(yǎng)肝，緩肝氣橫逆之脅痛；炙甘草甘以緩急，合生姜共奏有益氣補(bǔ)中之效；薄荷少許，助瀉肝郁之熱[4-5]。而目前由于現(xiàn)代中青年工作壓力較大，以及老齡化人口的日益增加，普遍存在肝郁氣滯、脾虛血虛的情況，因此大眾對于服用逍遙丸，疏肝健脾，養(yǎng)血和血的需求較大[6-8]；因此，薄荷作為逍遙丸中重要的藥材之一，控制好逍遙丸的質(zhì)量，預(yù)防在逍遙丸制作完成之前的基礎(chǔ)藥材存在摻偽的情況，尤其關(guān)鍵。薄荷和留蘭香屬于同科同屬的植物，兩者均屬于唇形科植物，性狀相近，因此無法在顯微鏡下鑒別[9]；然而兩者的主要成分和主治功效卻大相徑庭，薄荷主要成分是薄荷腦，主要功效為疏肝行氣，瀉肝郁之熱[10]；而留蘭香的主要成分是香芹酮，主要功效為解表和中[11]。目前薄荷藥材的檢查項中沒有香芹酮的檢查項，比較不容易發(fā)現(xiàn)藥材本身是否存在摻偽的問題，故本研究采集3個不同廠家各2個不同批次的逍遙丸進(jìn)行檢驗，以薄荷腦和香芹酮為對照品，旨在采用指紋圖譜分析逍遙丸的同時，建立其摻偽檢驗方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀(型號:7890 A，AGILENT安捷倫科技有限公司);全自動智能內(nèi)校分析天平(型號:PTY124，福州普力斯特科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑 由中國食品藥品檢定研究院提供的批號為0728-200005薄荷腦；由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH研究所提供的批號為00610的香芹酮；以及分析純購于Fisher scientific公司。

1.3 分析樣品 取3個不同廠家(A廠家:仲景宛西制藥股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z41021831;B廠家:九芝堂股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z43020469;C廠家:蘭州佛慈制藥股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z62020890)的逍遙丸，每個廠家各取2批不同生產(chǎn)批次的逍遙丸用研磨器研細(xì),精密取2 g逍遙丸粉末。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

為進(jìn)行摻偽檢驗方法建立，采用2種色譜方法進(jìn)行檢測，具體如下。

2.1.1 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS法) 采用質(zhì)譜檢測器，EI源，同時選用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷固定液(HP-5MS)毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，毛細(xì)管柱的進(jìn)樣口溫度為200 ℃；柱溫為程序升溫，具體升溫程序為初始溫度90 ℃，以3 ℃/min升溫至246 ℃，以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min，最后以FID檢測器溫度為300 ℃，全掃描方式，m/z 20～1 000，柱流量1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流。

2.2.2 氣相色譜法(GC) 采用DM-5(5%二苯基95%-二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1.5 μm)，其進(jìn)樣口溫度200 ℃，程序升溫(同2.2.1)，柱流量3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取薄荷腦和香芹酮對照品，分別加分析純(乙酸乙酯)制成每毫升含50 μg的對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取逍遙丸粉末0.5 g，加入200 mL水的揮發(fā)油測定容器中，充分搖勻，待粉末完全溶于水后加入2 mL分析純(乙酸乙酯)，參照《中華人民共和國藥典2010版一部附錄XD》[12]中揮發(fā)油測定的方法使揮發(fā)油測定容器保持微沸狀態(tài)2 h，取乙酸乙酯層作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液各5 μL，采用薄層層析方法(TLC)對逍遙丸進(jìn)行專屬性試驗，分別點(diǎn)與同一片硅膠G薄層色譜板，展開劑的配比為19環(huán)乙烷：1乙酸乙酯，經(jīng)過展開后，取出硅膠G薄層色譜板并晾干，隨即將含有2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液噴在色譜板上，加熱100 ℃，5 min后將色譜板放置于365 nm的紫外光燈下觀察，專屬性試驗結(jié)果顯示逍遙丸的專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液3、6、12、18、24 mL，分別置50 mL量瓶中，記錄峰面積；以混合對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，薄荷和香芹酮混合對照品溶液在0.060 21～0.113 48 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對標(biāo)注偏差RSD是0.91%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是0.94%。

2.8 重復(fù)性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同分析儀上檢測5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.90%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品溶液，進(jìn)行回收率試驗測定，計算結(jié)果顯示平均回收率為99.35%，RSD為0.86%。

2.10 樣品測定結(jié)果

2.10.1 GC色譜圖 如圖1顯示A廠逍遙丸供試品中未檢出香芹酮，而B、C廠均檢測出含有香芹酮，且C廠香芹酮PA值高于B廠。

2.10.2 逍遙丸GC-MS色譜圖 根據(jù)GC-MS色譜圖，采用正離子方式掃描，結(jié)果顯示，薄荷腦和香芹酮的GC-MS特征離子峰分別是m/z 41、55、71、81、95和m/z 39、54、82、93、108。見圖2。

表1 逍遙丸中薄荷腦和香芹酮含量測定(mg/g)

3 討論

3.1 摻偽方法建立的必要性 市場上售賣的薄荷藥材處理方式都是揉碎薄荷葉子，因此單純從藥材性狀上很難和同科同屬的留蘭香進(jìn)行顯微鑒別[13]，根據(jù)薄荷和留蘭香的主要成分不同，薄荷主要成分為薄荷腦，并不含有香芹酮[14]，因此本研究首先通過薄層層析法(TLC)對薄荷腦和香芹酮進(jìn)行專屬性試驗，進(jìn)行直接鑒別。當(dāng)通過TLC明確薄荷腦和香芹酮的專屬性后，根據(jù)《中華人民共和國藥典》附錄規(guī)定薄荷和留蘭香屬于同科同屬植物，在種植的時候容易混入，因此允許的雜質(zhì)最高限度是5%[15]，研究進(jìn)一步采用GC法對逍遙丸中薄荷腦和香芹酮進(jìn)行成分指紋圖譜分析，結(jié)果顯示A廠未檢測出香芹酮，而B、C廠均檢測出程度不等的香芹酮含量。為了進(jìn)一步確證，研究采用GC-MS法進(jìn)步對逍遙丸進(jìn)行指紋圖譜分析，在GC-MS質(zhì)譜圖中，與對照品色譜比較，供試品色譜圖不可以出現(xiàn)保留時間相同的色譜峰;若出現(xiàn)保留時間相同的色譜峰，則其一級質(zhì)譜不得與對照品的一級質(zhì)譜一致[16-18]。

3.2 展開劑和顯色劑的選擇 在專屬性試驗TLC法中展開劑和顯色劑的選擇尤為重要，其中展開劑的選擇能夠更好的讓目標(biāo)成分更好的與周圍的干擾斑點(diǎn)分開[19]，在本研究的前期試驗中曾采用甲苯-乙酸乙酯(19∶ 1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(10∶ 1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(10∶ 2)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)為展開劑，結(jié)果選用環(huán)己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)色譜效果最理想，香芹酮與周圍干擾的斑點(diǎn)可以分開。

而由于薄荷和留蘭香是同科同屬植物，薄荷藥材中與香芹酮Rf值相近的位置斑點(diǎn)顏色與香芹酮類似，可能會引起誤判，研究前期試驗中曾使用5%香草醛硫酸溶液作為顯色劑[20]，置熒光下檢視，未能將香芹酮斑點(diǎn)與周圍干擾斑點(diǎn)明確區(qū)分開，而采用2%對二甲氨基苯甲醛作為顯色劑時香芹酮斑點(diǎn)顏色與周圍斑點(diǎn)顏色明顯有區(qū)別。

圖1 逍遙丸GC色譜圖

注：1為薄荷腦；2為香芹酮

圖2 逍遙丸GC-MS色譜圖

3.3 毛細(xì)管柱的選擇 采用氣相色譜儀分析逍遙丸指紋圖譜中GC法和GC-MS法中毛細(xì)管柱的選擇尤其重要，其耐用性決定后續(xù)中精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素[21-23]，在GC法中選擇DM-5(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱和在GC-MS法中選擇HP-5MS(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱，2種毛細(xì)管柱均具有良好的分離度和塔板數(shù)，表明本研究中逍遙丸指紋圖譜選用的毛細(xì)管柱耐用性良好。

3.4 方法嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義 指紋圖譜中線性考察的意義在于分析樣品在某一個濃度或峰高(面積)情況是否是成線性的,根據(jù)朗伯比爾定律，待測樣品面積與濃度在這個線性范圍內(nèi)成正比，分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的[24]。而加樣回收率包括絕對回收率和相對回收率,其中相對回收率有一種是回收試驗法,另一種是加樣回收試驗法[25]。而本研究的目的主要是為了考察指紋圖譜檢測方法的嚴(yán)謹(jǐn)性,因此需要分析相對回收率，故而選用加樣回收試驗法,即在已知濃度樣品中加入藥物,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。