p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

閆 斌，馬 鐸，于躍利，韓麗紅*

(1.莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 福建省莆田 351100;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外二科,內(nèi)蒙古包頭 014010)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見女性惡性腫瘤之一，是女性癌癥患者死亡的主要原因，女性癌癥患者的死亡率為14%[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR信號通路在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、蛋白合成、新陳代謝、轉(zhuǎn)化和血管生成等過程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。mTOR信號通路的異常激活和許多類型的惡性腫瘤密切相關(guān)，在甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制已有相關(guān)報道。mTOR及其上下游分子成為乳腺癌治療的新靶點和主要預(yù)后指標(biāo)的研究仍在進行中，進一步探討該信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)機制與其他信號通路的關(guān)聯(lián)，有助于人們針對mTOR信號途徑來尋找新的抗腫瘤藥物[4]。本試驗通過免疫組織化學(xué)方法檢測了2015年3月至2017年8月在包頭市腫瘤醫(yī)院就治的60例乳腺癌患者的乳腺癌組織及40例癌旁組織p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表達情況，為乳腺癌的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 選自2015年3月至2017年8月于包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)根治切除的乳腺癌石蠟標(biāo)本60例及癌旁組織(腫瘤邊緣5 cm處)石蠟標(biāo)本40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)活檢證實為乳腺癌，根治性手術(shù)治療后留有石蠟包埋的組織標(biāo)本，所有標(biāo)本術(shù)前未接受化療、放療或內(nèi)分泌治療，無合并其他惡性腫瘤和遺傳病史，且具備完整臨床治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：男性乳腺癌，接受化療、放療、內(nèi)分泌治療。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)納入60例女性乳腺癌患者，其中年齡≥45歲27例，<45歲33例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例；乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期17例。

1.1.2 試劑 p-mTOR(Ser2448)一抗、P-4EBP1(Ser64)、P-S6K1(Thr389)一抗，江蘇厚普生物科技有限公司產(chǎn)品；抗體來源為兔，多克隆抗體，適用于人；HRP標(biāo)記抗兔二抗，購于福州邁新生物公司(KIT5006)；DAB顯色液，購于江蘇厚普生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 操作流程 (1)溫浴：將切片放置于62℃溫浴箱內(nèi)2 h。(2)切片脫蠟水化：將切片放置于二甲苯溶液中，每次15 min，共3次,使切片完全脫蠟，在梯度酒精中各浸泡5 min完全水化。(3)沖洗：用PBS沖洗脫蠟和水化后的切片3次，每次2 min，再用蒸餾水沖洗5 min。(4)修復(fù)抗原：檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)，高壓加熱2.5 min，取出切片冷卻至室溫。(5)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(6)內(nèi)源性過氧化物酶活性阻斷：將組織切片用30 mL/L H2O2室溫孵育10 min。(7)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(8)一抗孵育：將沖洗完的切片擦拭后，加上一抗(p-mTOR稀釋度1∶100；p-4EBP1稀釋度1∶100；p-S6K1稀釋度1∶50)4℃孵育過夜，次日37℃復(fù)溫60 min,PBS洗片3次，每次2 min。(9)二抗孵育：加二抗后，將濕盒置于37℃溫箱20 min，PBS洗片3次，每次2 min。(10)顯色：向切片滴加新配制的DAB顯示液2滴，置于顯微鏡下觀察組織切片5 min～10 min，調(diào)整著色，適時滴加蒸餾水終止顯色。(11)脫水?dāng)z片：梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固后置于顯微觀察并進行攝片。

1.2.2 染色結(jié)果的判斷 通過特異性抗原抗體反應(yīng)，使細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用雙盲法閱片，染色結(jié)果由2名病理科副主任醫(yī)師分別獨自判讀,對于不一致的判讀結(jié)果經(jīng)商討后得出一致結(jié)論。參照文獻[5]的標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞數(shù)0為(-)，0～20%為(±)，21%～80%為(+)，>80%為(++)；(-)和(±)為陰性，(+)和(++)為陽性。

1.2.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0軟件，組間陽性率比較采用四格表2檢驗及Fisher確切概率法檢驗，組間陽性率相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

在本次試驗的60例乳腺癌組織和40例癌旁組織中，p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1主要表達于乳腺組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色(圖1、圖2及圖3)。最后得出p-mTOR在乳腺癌組織中陽性表達的例數(shù)為43例，陽性率為71.7%(43/60)，癌旁組織中p-mTOR陽性表達的例數(shù)為17例，陽性率為42.5%(17/40)，乳腺癌組的陽性表達率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。p-4EBP1在乳腺癌組織中陽性表達的例數(shù)為16例，陽性率為26.7%(16/60)，癌旁組織中p-4EBP1陽性表達的例數(shù)為4例，陽性率為10.0%(4/40),乳腺癌組的陽性表達率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。p-S6K1在乳腺癌組織中陽性表達的例數(shù)為27例，陽性率為45.0%(27/60)，癌旁組織中p-S6K1陽性表達的例數(shù)為例，陽性率為12.5%(5/40)，乳腺癌組的陽性表達率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌中的表達情況

A.p-mTOR在癌旁組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中(20×10)；B.p-mTOR在乳腺癌組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中(20×10)

A.Expression of p-mTOR in paracancerous tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10); B.Expression of p-mTOR in breast cancer tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10)

圖1 p-mTOR在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達
Fig.1 Expression of p-mTOR in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-4EBP1在癌旁組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (20×10); B.p-4EBP1在乳腺癌組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(20×10)

A.Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissues(20×10); B.Expression of p-4EBP1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

圖2 p-4EBP1在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達
Fig.2 Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-S6K1在癌旁組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (20×10); B.p-S6K1在乳腺癌組織中的表達主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(20×10)

A.Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10); B.Expression of p-S6K1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

圖3 p-S6K1在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達
Fig.3 Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

3 討論

乳腺癌的發(fā)生是一個多級別、多步驟的過程，它涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活，導(dǎo)致了相關(guān)蛋白合成障礙，最終改變細(xì)胞生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致了腫瘤的生成。而m-TOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)一個重要信號通路，它的異常激活與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[5]。而且mTOR信號通路的紊亂影響許多非惡性腫瘤疾病的病理生理，如心血管，神經(jīng)退行性疾病和各種各樣的腎臟疾病。mTOR的活性受多種調(diào)節(jié)信號蛋白的影響，主要包括3條信號通路調(diào)節(jié)，分別是PI3K/AMPK/mTOR、LKB1/AMPk/mTOR和氨基酸通路。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種進化上十分保守的蛋白激酶，通過整合生長因子，氨基酸和能量等環(huán)境信號發(fā)揮著重要的作用[6]。mTOR在生物體內(nèi)以mTORC1和mTORC2兩種形式存在，mTORC1控制蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞代謝反應(yīng)，mTORC2調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生存期。mTOR激活后，可磷酸化其下游分子4EBP1和S6K1，進而增強蛋白質(zhì)的合成，促進腫瘤的生長、增殖、遷移及腫瘤血管的生成。因此，mTOR途徑的過度激活會導(dǎo)致細(xì)胞生長和增殖，也可以刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。4EBP1和S6K1是目前研究最廣泛的mTOR的底物。

根據(jù)基因表達譜和分子生物學(xué)標(biāo)記物的表達情況，可以將乳腺癌分為4種亞型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達型和三陰性乳腺癌[7]。信號通路的異常激活在不同亞型乳腺癌中存在差異。王杰等[8]采用組織芯片技術(shù)和免疫組化染色方法,檢測p-mTOR在75例Luminal A型乳腺癌患者和136例Luminal B型乳腺癌患者中的表達情況及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。得出p-mTOR在乳腺癌不同亞型患者中的多樣化表達特點提示不同的疾病行為及預(yù)后意義。p-mTOR作為Luminal B型乳腺癌的獨立預(yù)后因素,是潛在的有效靶點。本研究結(jié)果顯示p-mTOR在觀察組和對照組的陽性率分別為71.7%和42.5%，p-4EBP1在觀察組和對照組的陽性率分別為26.7%和10.0%，p-S6K1在觀察組和對照組的陽性率分別為45.0%和12.5%。p-mTOR、p-mTOR及p-S6K1 在胃癌組織當(dāng)中相應(yīng)表達水平高于癌旁組織，差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果顯示mTOR、4EBP1和S6K1在乳腺癌組織中高表達，提示mTOR、4EBP1和S6K1可能與乳腺癌的發(fā)生有密切關(guān)系，為mTOR、4EBP1和S6K1是否能作為乳腺癌的標(biāo)記物提供更多的證據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn)mTOR磷酸化水平從正常的乳腺組織到不典型增生的乳腺組織，再到惡性轉(zhuǎn)化的組織，以致到腫瘤浸潤的組織中逐漸增加。

已報道m(xù)TOR信號通路異常存在于胃癌、肺癌等惡性腫瘤中[9]。一些機制仍然沒有闡明清楚，例如mTOR如何協(xié)同其他信號通路和蛋白質(zhì)調(diào)控細(xì)胞的運動和入侵；mTOR是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附/去黏附功能的。顯然，需要更多的研究來闡明這些機制，增加對腫瘤轉(zhuǎn)移理解，并為新的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供更多的證據(jù)[10]。

綜上所述，mTOR及其下游信號分子4EBP1和S6K1在乳腺癌中的表達升高與乳腺癌的發(fā)展有關(guān)，可通過進一步研究乳腺癌中mTOR及其下游信號分子4EBP1和S6K1與病理分期、生存期的研究，對于臨床上對乳腺癌的診斷和治療有一定的指導(dǎo)意義。