• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    副雞嗜血桿菌貴州株的分離鑒定

    2018-12-24 11:50:30林漢卿溫貴蘭汪德生張升波李昌紅周碧君程振濤
    動物醫(yī)學進展 2018年12期
    關(guān)鍵詞:嗜血瓊脂革蘭

    林漢卿,溫貴蘭,汪德生,張升波,徐 麗,李昌紅,文 明,周碧君,程振濤

    (1.貴州大學動物科學學院/貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.思南縣動物疫病預防控制中心,貴州銅仁 565100)

    副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum,Hpg)又名副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg),是雞傳染性鼻炎(Infectiuns coryza,IC)的病原菌,該菌常引起雞發(fā)生顏面腫脹、流鼻涕、呼吸困難和結(jié)膜炎[1]。傳染性鼻炎是一種急性呼吸道傳染病,主要危害育成雞和產(chǎn)蛋雞,可使蛋雞產(chǎn)蛋量下降,肉雞生長受阻、肉質(zhì)下降,發(fā)病率高而病死率低[2]。雞是本病的主要宿主,但也有其他禽類感染該病的病例[3]。該病呈世界性分布,1920年Beach第一次報道該病,我國從1980年起陸續(xù)有疑似病例出現(xiàn),馮文達等[4]于1987年首次在我國分離到副雞嗜血桿菌。副雞嗜血桿菌屬于巴氏桿菌科禽桿菌屬[5],是一種革蘭陰性球桿菌,兩極著色,無芽胞,無鞭毛,部分致病菌有莢膜[6]。該菌對生長要求較高,大部分菌株都有NAD(輔酶Ⅰ)依賴性,需要在培養(yǎng)基中添加NAD和血清[7]。Page通過凝集試驗法將副雞嗜血桿菌分為A、B、C 3個血清型,且各型之間不產(chǎn)生交叉保護[8],目前我國主要流行的血清型為A型[9]。研究認為A型為主要致病血清型,C型菌株也存在不同程度的致病力,而B型是否致病還存在一定爭議[10-12]。本試驗從貴州一規(guī)模化土雞養(yǎng)殖場疑似病例中分離到1株細菌,經(jīng)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗及16 S rRNA序列比對,鑒定其為C型副雞嗜血桿菌,藥敏試驗篩選出了該菌的敏感藥物,致病性試驗表明,該分離菌為低致病性菌株。研究結(jié)果可為規(guī)?;B(yǎng)殖場副雞嗜血桿菌的防治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    病料來自貴州某規(guī)模化養(yǎng)雞場送檢的疑似患病雞;革蘭染料、藥敏片、生化鑒定管、營養(yǎng)瓊脂,均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;胎牛血清,海博生物有限公司產(chǎn)品;NAD,BBI公司產(chǎn)品;細菌DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;2×EsTaqDNA Polymerase,康為世紀公司產(chǎn)品;DNA Marker DL 2 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;葡萄球菌菌株,貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存菌株;10日齡小雞,購自貴州大學農(nóng)場。

    1.2 方法

    1.2.1 流行病學調(diào)查 觀察送檢病雞的臨床表現(xiàn),詢問養(yǎng)殖戶流行情況,并對病雞進行剖檢,觀察檢剖病理變化。

    1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 在無菌條件下,用接菌環(huán)從送檢雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟和眶下竇等組織器官取樣,接種于巧克力瓊脂平板上,分別在厭氧與需氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后,挑選單個菌落在含40 μg/mL NAD和50 mL/L胎牛血清的液體培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后選擇明顯變渾濁的液體培養(yǎng)基進行革蘭染色鏡檢。

    1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察 吸取50 μL純培養(yǎng)物于巧克力瓊脂平板上,用LB棒涂抹均勻,然后用接菌環(huán)蘸取少量實驗室保存的葡萄球菌在平板上劃一條線,置于37℃培養(yǎng)18 h~20 h,觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

    1.2.4 生化鑒定 用接種環(huán)接種純培養(yǎng)菌液在細菌生化管內(nèi),在生化管中加入適量40 μg/mL的NAD和胎牛血清,于37℃培養(yǎng)48 h之后進行觀察記錄,生化鑒定結(jié)果判定參照說明書進行。

    1.2.5 藥敏試驗 取100 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于含NAD的巧克力瓊脂平板上,用紙片法將頭孢克洛、青霉素、四環(huán)素、頭孢拉定、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、紅霉素、復方新諾明、鏈霉素共10種藥敏片粘貼于平板上,于37 ℃培養(yǎng)24 h,記錄所有藥敏片的抑菌圈大小,并根據(jù)表1的標準進行敏感性判定。

    表1 藥敏試驗判定標準

    1.2.6 16 S rRNA的PCR擴增與測序

    1.2.6.1 引物設(shè)計 參考文獻[13]合成1對細菌16 S rRNA通用引物,引物序列為上游引物:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;下游引物:5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′,預擴增片段長度約為1 500 bp,引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序合成。

    1.2.6.2 細菌DNA的提取及PCR擴增 參照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取細菌DNA,用如下體系進行PCR擴增:上、下游引物各1 μL,2×EsTaqDNA Polymerase 12.5 μL,DNA 2 μL,H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 min,共30個循環(huán);72 ℃ 2 min。反應(yīng)結(jié)束后,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并將PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

    1.2.6.3 16 S rRNA序列分析 用DNA Star7.0軟件將測得分離菌株的16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的標準副雞嗜血桿菌菌株序列進行核苷酸同源性分析,并繪制遺傳進化樹。

    1.2.7 動物感染試驗 將細菌稀釋于新的含NAD和胎牛血清的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h~20 h,用同樣的培養(yǎng)基進行101、102、103、104倍稀釋。用涂片法取原液及每種稀釋度的菌液分別各100 μL,均勻涂抹在巧克力平板上,每種濃度做3個平行,置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h~18 h后進行菌落計數(shù)。將未免疫過傳染性鼻炎的10日齡小雞隨機分成6組,每組3只。分別取0.1 mL液體培養(yǎng)基、細菌原液及每種稀釋度的菌液接種于各組小雞的眶下竇,每日觀察小雞發(fā)病情況,并取其內(nèi)臟及鼻竇分泌物進行細菌的分離培養(yǎng)。

    2 結(jié)果

    2.1 發(fā)病情況及臨床癥狀調(diào)查結(jié)果

    該養(yǎng)殖場存欄10 000多只雞,日死亡20只左右,發(fā)病雞可見精神沉郁、部分可見顏面腫脹、流淚、流清亮鼻液、呼吸啰音。觀察送檢雞,可見眼部腫大、流膿液,鼻腔流清亮鼻液,關(guān)節(jié)輕微腫大。剖檢送檢雞,可見肝臟有白色病灶,心包積液,心臟腫大,脾臟腫大且有大理石樣病變(圖1和圖2)。

    2.2 細菌分離培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果

    經(jīng)37℃厭氧及需氧培養(yǎng)24 h后,從病例所有組織分離到的細菌在普通瓊脂平板上均不生長。肝臟及眶下竇分離菌在巧克力瓊脂平板上均長出半透明、露珠狀、邊緣整齊的小菌落,將其命名為HPG-GZ-2017,其他組織未分離到。革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示,該分離菌為兩極濃染的革蘭陰性短小桿菌。

    2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察結(jié)果

    培養(yǎng)18 h后,在HPG-GZ-2017與金黃色葡萄球菌同時存在的巧克力瓊脂平板上,可見靠近葡萄球菌的分離菌菌落較大,而遠離葡萄球菌的菌落則相對較小(圖3)。

    2.4 分離菌生化試驗結(jié)果

    HPG-GZ-2017硝酸鹽還原試驗陰性;硫化氫、吲哚試驗、靛基質(zhì)試驗陰性;過氧化酶試驗陰性而氧化酶試驗陽性。該菌能發(fā)酵甘露糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不能發(fā)酵半乳糖。

    圖1 病雞眼瞼腫大、流膿

    圖2 肝臟有白色病灶

    圖3 分離株形成的衛(wèi)星現(xiàn)象

    2.5 分離菌藥敏試驗結(jié)果

    HPG-GZ-2017對頭孢克洛高敏,對紅霉素中敏,對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、青霉素、諾氟沙星、頭孢拉定低敏,對復方新諾明、鏈霉素耐藥(表2)。

    2.6 分離菌16 S rRNA PCR擴增結(jié)果

    經(jīng)凝膠電泳檢測,分離株HPG-GZ-2017的16 S rRNA PCR擴增結(jié)果與預期相符,片段長度約為1 450 bp(圖4)。

    2.7 分離菌16 S rRNA序列分析結(jié)果

    測序得到1 437 bp大小序列,將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的各亞型標準副雞嗜血桿菌菌株進行比對,核苷酸同源性為93.6%~99.4%。

    2.7.1 核苷酸同源性分析結(jié)果 核苷酸同源性分析表明,HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標準菌株CAPM 5113(GenBank:DQ229071)的同源性高達99.4%,與C型標準菌株HP107(GenBank:GU951544)、CAPM 5111(GenBank:M75056)、Modesto(GenBank:AY498870)的同源性都相對較高,分別為98.0%、98.2%、98.0%,與A、B型標準菌株的同源性在93.6%~97.3%之間(圖5)。

    表2 分離細菌藥敏試驗結(jié)果

    M.DNA 標準DL 2 000; -.陰性對照;1~2.分離物

    M.DNA Marker DL 2 000; -.Negative control;1-2.Isolates

    圖4分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

    Fig.4 PCR identification results of isolates

    2.7.2 系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果 系統(tǒng)進化樹分析顯示(圖6),HPG-GZ-2017與C型標準菌株CAPM 5111(GenBank:M75056)處于同一小分支,親緣關(guān)系最近,與A型標準菌株M10071(GenBank:AY613734)、M9919(GenBank:AY613739)以及B型標準菌株M6755(GenBank:AY613719.1)、M10816(GenBank:AY613725)親緣關(guān)系最遠。

    2.8 動物感染試驗結(jié)果

    將HPG-GZ-2017菌株接種各組10日齡小雞,4 d后各梯度試驗組和對照組雞均食欲正常,精神良好,沒有復制出IC典型特征癥狀。而各稀釋度菌株接種的巧克力瓊脂平板在24 h后均長出很密集的透明小菌落,根據(jù)計數(shù)原則全判定為多不可數(shù)。將試驗組雞處死并剖檢,其內(nèi)臟均未出現(xiàn)明顯病變,蘸取眶下竇分泌物接種于巧克力平板培養(yǎng)后長成與初分離菌形態(tài)一致的菌落,革蘭染色形態(tài)也與初分離時的形態(tài)一致。

    圖5 分離菌株HPG-GZ-2017株16 S rRNA序列同源性比對結(jié)果

    圖6 分離菌株HPG-GZ-2017 16 S rRNA序列系統(tǒng)進化樹

    3 討論

    本試驗的病料來源于貴州省某規(guī)模化養(yǎng)殖場,病雞有眼瞼腫大、流鼻液及呼吸困難等癥狀,與傳染性鼻炎典型癥狀相符。剖檢可見心包積液,這可能與A、C菌株分離的多糖有關(guān)[14]。另外,本試驗同時從病雞體內(nèi)檢測到了禽白血病病毒病原核酸,這很可能是引起病雞肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)的原因。

    該分離菌在未加NAD的血平板上不生長,在同樣未加NAD的巧克力平板上生長良好。這是因為巧克力平板制作過程中紅細胞會破裂,進而釋放出有利于該菌生長的Ⅴ因子(NADH)。在該菌與產(chǎn)NAD的葡萄球菌交叉劃線的巧克力平板上可見明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象,這些現(xiàn)象表明,該分離菌株具有NAD依賴性,這是鑒別該菌的重要依據(jù)[15-16]。細菌菌落為邊緣整齊的半透明小菌落,革蘭染色可見該菌為紅色的兩極濃染的短小桿菌,都符合副雞嗜血桿菌的特性。生化試驗結(jié)果表明,HPG-GZ-2017不能發(fā)酵半乳糖,且不含過氧化氫酶,說明該菌為副雞嗜血桿菌,而非其他禽桿菌[16]。由以上結(jié)果基本可判定該分離菌為副雞嗜血桿菌,將其命名為HPG-GZ-2017。序列分析結(jié)果表明,HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標準菌株CAPM 5113(GenBank:DQ229071)的同源性高達99.4%,由此可確定該菌株為嗜血桿菌。該菌與C型標準菌株的同源性比與A、B兩型標準菌株都高,且與C型菌株的親緣關(guān)系最近,因此確定該菌株為C型嗜血桿菌。

    將HPG-GZ-2017接種于未免疫傳染性鼻炎疫苗的10日齡小雞,4 d后可從小雞體內(nèi)分離到該細菌,但小雞不發(fā)生明顯病變,而貴州省某規(guī)模化養(yǎng)殖場的雞可見明顯的傳染性鼻炎典型癥狀,這可能受多種原因的影響。雖然各個年齡段的雞都可感染副雞嗜血桿菌,但成年雞的易感性遠大于雛雞[17],試驗雞日齡過小可能是未能復制出IC特征癥狀的其中一個原因。另外,雞場的飼養(yǎng)環(huán)境、感染劑量和感染方式等也可能是影響動物感染試驗結(jié)果的原因。為探明危害雞場雞的主要病原,我們對雞場送檢雞進行了一些常見的禽類病毒的病原核酸檢測,發(fā)現(xiàn)病雞體內(nèi)含有高濃度的J亞型禽白血病病毒。禽白血病是一種免疫抑制病,可降低雞的抵抗力,繼發(fā)其他病原的感染。雞場送檢雞患有禽白血病很可能是其出現(xiàn)典型IC癥狀的重要原因。藥敏試驗結(jié)果顯示,HPG-GZ-2017對頭孢克洛高度敏感,對大多數(shù)藥物低敏或耐藥,這與雞場濫用抗菌藥物有很大關(guān)系。防治傳染性鼻炎,不僅要注重飼養(yǎng)管理、嚴格執(zhí)行疫苗防疫,還應(yīng)注意預防禽白血病、馬立克病等免疫抑制性疾病的感染。

    猜你喜歡
    嗜血瓊脂革蘭
    腫瘤醫(yī)院感染患者革蘭陽性菌分布與耐藥性及經(jīng)驗性抗MRSA的研究
    馬傳染性貧血瓊擴試驗中瓊脂配比濃度及溫度因素對瓊脂板制作的影響
    淺述豬副嗜血桿菌病的綜合防治
    歐盟食品安全局重新評估瓊脂作為食品添加劑的安全性
    建構(gòu)數(shù)學模型領(lǐng)悟細胞大小與物質(zhì)運輸?shù)年P(guān)系
    生物學教學(2016年9期)2016-08-21 02:37:00
    副豬嗜血桿菌病及其診治體會
    2011—2013年非發(fā)酵革蘭陰性桿菌耐藥監(jiān)測結(jié)果分析
    基層醫(yī)院ICU與非ICU主要革蘭陰性桿菌分布與耐藥性差異
    河市某規(guī)模豬場副豬嗜血桿菌病的診斷與防治
    一起豬圓環(huán)病毒病并發(fā)副豬嗜血桿菌病的診治
    国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产久久久一区二区三区| 老司机福利观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产黄片美女视频| 色在线成人网| 超碰av人人做人人爽久久| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲在线自拍视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 少妇人妻精品综合一区二区 | 最近手机中文字幕大全| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品免费一区二区三区在线| 一本久久中文字幕| 男女那种视频在线观看| 日本黄大片高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久久久午夜电影| 51国产日韩欧美| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人av在线播放网站| 国产 一区 欧美 日韩| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 好男人在线观看高清免费视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美在线乱码| 国产三级在线视频| 嫩草影院新地址| 美女高潮的动态| 18+在线观看网站| 一个人看的www免费观看视频| 在线天堂最新版资源| 日本与韩国留学比较| www日本黄色视频网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一级黄片播放器| 国产av麻豆久久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 国产一区二区激情短视频| 最近在线观看免费完整版| 日本一本二区三区精品| 两个人的视频大全免费| 丰满乱子伦码专区| 国产亚洲欧美98| 在线播放无遮挡| 男人舔奶头视频| 成人特级av手机在线观看| 简卡轻食公司| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品人妻视频免费看| 欧美性猛交黑人性爽| 岛国在线免费视频观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 日韩av在线大香蕉| 最近在线观看免费完整版| 国产v大片淫在线免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人永久免费在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品一区二区性色av| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久午夜福利片| 日本在线视频免费播放| 插逼视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| 联通29元200g的流量卡| 国产av在哪里看| av在线天堂中文字幕| 日本黄色片子视频| 网址你懂的国产日韩在线| 一区福利在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲国产精品合色在线| www.色视频.com| 中国美女看黄片| 级片在线观看| 全区人妻精品视频| 亚洲熟妇熟女久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人freesex在线 | 国产探花在线观看一区二区| 日本五十路高清| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年免费大片在线观看| 伦理电影大哥的女人| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美日韩乱码在线| 99久国产av精品| 不卡视频在线观看欧美| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 色尼玛亚洲综合影院| 一级黄色大片毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 性色avwww在线观看| 国产高清三级在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲av不卡在线观看| 国产毛片a区久久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲精品影视一区二区三区av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99在线人妻在线中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品野战在线观看| 国产 一区精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99热精品在线国产| 亚洲丝袜综合中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲性久久影院| 久久久久久久午夜电影| 亚洲五月天丁香| 久久99热6这里只有精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产伦在线观看视频一区| 国产免费一级a男人的天堂| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99热网站在线观看| 久久久精品94久久精品| 午夜免费激情av| 老司机午夜福利在线观看视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产毛片a区久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 少妇的逼好多水| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 永久网站在线| 成人国产麻豆网| 日本免费a在线| 国产精品一二三区在线看| 丝袜喷水一区| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费观看的影片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 免费黄网站久久成人精品| 人人妻人人看人人澡| av天堂中文字幕网| 大型黄色视频在线免费观看| 少妇丰满av| 成年女人永久免费观看视频| 日本欧美国产在线视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲国产色片| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩成人伦理影院| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费高清视频大片| 在现免费观看毛片| 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 色5月婷婷丁香| 91精品国产九色| 91狼人影院| 亚洲成人av在线免费| eeuss影院久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 成人综合一区亚洲| 三级经典国产精品| 男人舔女人下体高潮全视频| a级毛片a级免费在线| 欧美色视频一区免费| 亚洲在线自拍视频| 亚洲国产精品合色在线| 午夜影院日韩av| 久久久久久久久久黄片| 亚洲国产精品成人综合色| 免费看av在线观看网站| 免费人成在线观看视频色| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美bdsm另类| 午夜亚洲福利在线播放| 成人二区视频| 亚洲性久久影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕熟女人妻在线| 国产色婷婷99| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品精品国产色婷婷| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久韩国三级中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产免费一级a男人的天堂| 天堂动漫精品| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产三级中文精品| 我要看日韩黄色一级片| 精品无人区乱码1区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产 一区精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产男靠女视频免费网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产午夜精品论理片| 亚洲av美国av| 直男gayav资源| 最好的美女福利视频网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品免费久久久久久久清纯| 看片在线看免费视频| 国产成人91sexporn| 最新在线观看一区二区三区| 97碰自拍视频| 午夜免费激情av| 伊人久久精品亚洲午夜| 乱人视频在线观看| 麻豆一二三区av精品| 99热网站在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产午夜精品论理片| 波多野结衣高清作品| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲国产精品合色在线| 九九热线精品视视频播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一区福利在线观看| 久久久久性生活片| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人影院久久av| 一级毛片我不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲91精品色在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜福利18| 日韩亚洲欧美综合| 欧美三级亚洲精品| 插阴视频在线观看视频| 波野结衣二区三区在线| 两个人视频免费观看高清| 人人妻人人看人人澡| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| www日本黄色视频网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲第一区二区三区不卡| 色播亚洲综合网| 免费av观看视频| 长腿黑丝高跟| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜a级毛片| 久久久久性生活片| 97碰自拍视频| 成人性生交大片免费视频hd| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久久大精品| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品国产自在天天线| a级毛色黄片| 91久久精品电影网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品女同一区二区软件| 看黄色毛片网站| 丰满的人妻完整版| 国产美女午夜福利| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩欧美免费精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲电影在线观看av| 美女内射精品一级片tv| 色综合色国产| 久久韩国三级中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 岛国在线免费视频观看| 国内精品一区二区在线观看| 综合色av麻豆| 亚洲欧美成人精品一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 观看免费一级毛片| 香蕉av资源在线| 亚洲av不卡在线观看| 午夜福利18| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 黄色配什么色好看| 最近中文字幕高清免费大全6| 中国美白少妇内射xxxbb| 麻豆国产97在线/欧美| 淫妇啪啪啪对白视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品久久久久久久久免| 国产男靠女视频免费网站| 国产麻豆成人av免费视频| 国产高潮美女av| 日本欧美国产在线视频| av在线蜜桃| 日韩高清综合在线| 国产视频一区二区在线看| 中国国产av一级| 精品一区二区三区av网在线观看| av在线观看视频网站免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产高清三级在线| 国产精品福利在线免费观看| 欧美成人a在线观看| 午夜视频国产福利| 午夜a级毛片| 国产美女午夜福利| 网址你懂的国产日韩在线| 有码 亚洲区| 校园春色视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 观看美女的网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 99久久中文字幕三级久久日本| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久中文看片网| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲国产精品成人综合色| 日韩精品中文字幕看吧| 六月丁香七月| 亚洲中文字幕日韩| 久久九九热精品免费| 成年女人看的毛片在线观看| 午夜精品在线福利| 我的老师免费观看完整版| 禁无遮挡网站| 91久久精品电影网| 秋霞在线观看毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99久国产av精品国产电影| 搞女人的毛片| 亚洲18禁久久av| 日本黄色片子视频| 久久国产乱子免费精品| 精品久久久久久成人av| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 99热6这里只有精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产69精品久久久久777片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费看日本二区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 女人被狂操c到高潮| 国产精品无大码| 极品教师在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线免费观看的www视频| 丝袜喷水一区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产亚洲精品av在线| 一级毛片久久久久久久久女| 色综合色国产| 午夜免费激情av| 国产成人精品久久久久久| 午夜精品在线福利| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女 人体艺术 gogo| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美3d第一页| 久久亚洲精品不卡| 亚洲人成网站高清观看| 色综合站精品国产| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 色尼玛亚洲综合影院| 色吧在线观看| 看片在线看免费视频| 听说在线观看完整版免费高清| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日韩欧美免费精品| 一个人看的www免费观看视频| 日韩欧美精品免费久久| 日韩欧美 国产精品| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品无大码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 日本一本二区三区精品| 亚洲无线在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线免费十八禁| 蜜臀久久99精品久久宅男| 99久国产av精品| 99久久精品热视频| 国产探花在线观看一区二区| 深爱激情五月婷婷| 亚洲经典国产精华液单| 国内精品宾馆在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费看日本二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清三级在线| 日韩强制内射视频| 国产毛片a区久久久久| 国产成人影院久久av| 黄色日韩在线| 日韩亚洲欧美综合| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品日产1卡2卡| 国产精品一及| 99久久精品一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 又爽又黄无遮挡网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 淫妇啪啪啪对白视频| or卡值多少钱| 国产黄片美女视频| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国内精品美女久久久久久| 欧美激情在线99| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲四区av| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲精品色激情综合| 赤兔流量卡办理| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线天堂最新版资源| 国产麻豆成人av免费视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 级片在线观看| a级毛片a级免费在线| 日韩精品中文字幕看吧| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 人妻久久中文字幕网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 51国产日韩欧美| 黄片wwwwww| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美性猛交黑人性爽| 黄色配什么色好看| 老司机影院成人| 日本五十路高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 波多野结衣高清作品| 中文资源天堂在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 男人舔奶头视频| 成年av动漫网址| 久久精品影院6| 国产免费男女视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日本与韩国留学比较| 99久久成人亚洲精品观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产成人a区在线观看| 成人特级av手机在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 午夜福利18| 国产综合懂色| 深爱激情五月婷婷| 亚洲中文字幕日韩| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产av麻豆久久久久久久| 成人午夜高清在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 中出人妻视频一区二区| 亚洲精品色激情综合| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 波多野结衣高清无吗| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 伦理电影大哥的女人| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 观看免费一级毛片| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲中文字幕日韩| 欧美3d第一页| 亚洲18禁久久av| 伊人久久精品亚洲午夜| 麻豆国产av国片精品| 深夜a级毛片| 精品一区二区三区av网在线观看| 男女之事视频高清在线观看| av在线蜜桃| 精品日产1卡2卡| 九色成人免费人妻av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一个人看的www免费观看视频| 国产美女午夜福利| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 美女高潮的动态| 久久久久久久久久黄片| 不卡视频在线观看欧美| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩精品有码人妻一区| 美女被艹到高潮喷水动态| 夜夜爽天天搞| 久久精品人妻少妇| 日本三级黄在线观看| 在线免费观看的www视频| 99精品在免费线老司机午夜| 嫩草影院精品99| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲高清免费不卡视频| 99视频精品全部免费 在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年女人看的毛片在线观看| 最近在线观看免费完整版| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 黄色欧美视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品免费久久久久久久清纯| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 欧美日本视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久九九精品影院| 国产高清视频在线播放一区| 国产日本99.免费观看| 美女大奶头视频| 国产乱人偷精品视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 99久久精品一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人freesex在线 | 精品不卡国产一区二区三区| 最近在线观看免费完整版| 国产av在哪里看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| av天堂中文字幕网| 干丝袜人妻中文字幕| 哪里可以看免费的av片| 亚洲av五月六月丁香网| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人freesex在线 | avwww免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜福利视频1000在线观看| 美女大奶头视频| 午夜视频国产福利| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久精品国产自在天天线| 97超碰精品成人国产| 国产亚洲av嫩草精品影院| avwww免费| 色5月婷婷丁香| 久久久色成人| 日本 av在线| 日韩成人伦理影院| 国产淫片久久久久久久久| 热99在线观看视频| 日韩成人伦理影院| 国产真实乱freesex|