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    副雞嗜血桿菌貴州株的分離鑒定

    2018-12-24 11:50:30林漢卿溫貴蘭汪德生張升波李昌紅周碧君程振濤
    動物醫(yī)學進展 2018年12期
    關(guān)鍵詞:嗜血瓊脂革蘭

    林漢卿,溫貴蘭,汪德生,張升波,徐 麗,李昌紅,文 明,周碧君,程振濤

    (1.貴州大學動物科學學院/貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.思南縣動物疫病預防控制中心,貴州銅仁 565100)

    副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum,Hpg)又名副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg),是雞傳染性鼻炎(Infectiuns coryza,IC)的病原菌,該菌常引起雞發(fā)生顏面腫脹、流鼻涕、呼吸困難和結(jié)膜炎[1]。傳染性鼻炎是一種急性呼吸道傳染病,主要危害育成雞和產(chǎn)蛋雞,可使蛋雞產(chǎn)蛋量下降,肉雞生長受阻、肉質(zhì)下降,發(fā)病率高而病死率低[2]。雞是本病的主要宿主,但也有其他禽類感染該病的病例[3]。該病呈世界性分布,1920年Beach第一次報道該病,我國從1980年起陸續(xù)有疑似病例出現(xiàn),馮文達等[4]于1987年首次在我國分離到副雞嗜血桿菌。副雞嗜血桿菌屬于巴氏桿菌科禽桿菌屬[5],是一種革蘭陰性球桿菌,兩極著色,無芽胞,無鞭毛,部分致病菌有莢膜[6]。該菌對生長要求較高,大部分菌株都有NAD(輔酶Ⅰ)依賴性,需要在培養(yǎng)基中添加NAD和血清[7]。Page通過凝集試驗法將副雞嗜血桿菌分為A、B、C 3個血清型,且各型之間不產(chǎn)生交叉保護[8],目前我國主要流行的血清型為A型[9]。研究認為A型為主要致病血清型,C型菌株也存在不同程度的致病力,而B型是否致病還存在一定爭議[10-12]。本試驗從貴州一規(guī)模化土雞養(yǎng)殖場疑似病例中分離到1株細菌,經(jīng)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗及16 S rRNA序列比對,鑒定其為C型副雞嗜血桿菌,藥敏試驗篩選出了該菌的敏感藥物,致病性試驗表明,該分離菌為低致病性菌株。研究結(jié)果可為規(guī)?;B(yǎng)殖場副雞嗜血桿菌的防治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    病料來自貴州某規(guī)模化養(yǎng)雞場送檢的疑似患病雞;革蘭染料、藥敏片、生化鑒定管、營養(yǎng)瓊脂,均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;胎牛血清,海博生物有限公司產(chǎn)品;NAD,BBI公司產(chǎn)品;細菌DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;2×EsTaqDNA Polymerase,康為世紀公司產(chǎn)品;DNA Marker DL 2 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;葡萄球菌菌株,貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存菌株;10日齡小雞,購自貴州大學農(nóng)場。

    1.2 方法

    1.2.1 流行病學調(diào)查 觀察送檢病雞的臨床表現(xiàn),詢問養(yǎng)殖戶流行情況,并對病雞進行剖檢,觀察檢剖病理變化。

    1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 在無菌條件下,用接菌環(huán)從送檢雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟和眶下竇等組織器官取樣,接種于巧克力瓊脂平板上,分別在厭氧與需氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后,挑選單個菌落在含40 μg/mL NAD和50 mL/L胎牛血清的液體培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后選擇明顯變渾濁的液體培養(yǎng)基進行革蘭染色鏡檢。

    1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察 吸取50 μL純培養(yǎng)物于巧克力瓊脂平板上,用LB棒涂抹均勻,然后用接菌環(huán)蘸取少量實驗室保存的葡萄球菌在平板上劃一條線,置于37℃培養(yǎng)18 h~20 h,觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

    1.2.4 生化鑒定 用接種環(huán)接種純培養(yǎng)菌液在細菌生化管內(nèi),在生化管中加入適量40 μg/mL的NAD和胎牛血清,于37℃培養(yǎng)48 h之后進行觀察記錄,生化鑒定結(jié)果判定參照說明書進行。

    1.2.5 藥敏試驗 取100 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于含NAD的巧克力瓊脂平板上,用紙片法將頭孢克洛、青霉素、四環(huán)素、頭孢拉定、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、紅霉素、復方新諾明、鏈霉素共10種藥敏片粘貼于平板上,于37 ℃培養(yǎng)24 h,記錄所有藥敏片的抑菌圈大小,并根據(jù)表1的標準進行敏感性判定。

    表1 藥敏試驗判定標準

    1.2.6 16 S rRNA的PCR擴增與測序

    1.2.6.1 引物設(shè)計 參考文獻[13]合成1對細菌16 S rRNA通用引物,引物序列為上游引物:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;下游引物:5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′,預擴增片段長度約為1 500 bp,引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序合成。

    1.2.6.2 細菌DNA的提取及PCR擴增 參照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取細菌DNA,用如下體系進行PCR擴增:上、下游引物各1 μL,2×EsTaqDNA Polymerase 12.5 μL,DNA 2 μL,H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 min,共30個循環(huán);72 ℃ 2 min。反應(yīng)結(jié)束后,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并將PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

    1.2.6.3 16 S rRNA序列分析 用DNA Star7.0軟件將測得分離菌株的16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的標準副雞嗜血桿菌菌株序列進行核苷酸同源性分析,并繪制遺傳進化樹。

    1.2.7 動物感染試驗 將細菌稀釋于新的含NAD和胎牛血清的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h~20 h,用同樣的培養(yǎng)基進行101、102、103、104倍稀釋。用涂片法取原液及每種稀釋度的菌液分別各100 μL,均勻涂抹在巧克力平板上,每種濃度做3個平行,置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h~18 h后進行菌落計數(shù)。將未免疫過傳染性鼻炎的10日齡小雞隨機分成6組,每組3只。分別取0.1 mL液體培養(yǎng)基、細菌原液及每種稀釋度的菌液接種于各組小雞的眶下竇,每日觀察小雞發(fā)病情況,并取其內(nèi)臟及鼻竇分泌物進行細菌的分離培養(yǎng)。

    2 結(jié)果

    2.1 發(fā)病情況及臨床癥狀調(diào)查結(jié)果

    該養(yǎng)殖場存欄10 000多只雞,日死亡20只左右,發(fā)病雞可見精神沉郁、部分可見顏面腫脹、流淚、流清亮鼻液、呼吸啰音。觀察送檢雞,可見眼部腫大、流膿液,鼻腔流清亮鼻液,關(guān)節(jié)輕微腫大。剖檢送檢雞,可見肝臟有白色病灶,心包積液,心臟腫大,脾臟腫大且有大理石樣病變(圖1和圖2)。

    2.2 細菌分離培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果

    經(jīng)37℃厭氧及需氧培養(yǎng)24 h后,從病例所有組織分離到的細菌在普通瓊脂平板上均不生長。肝臟及眶下竇分離菌在巧克力瓊脂平板上均長出半透明、露珠狀、邊緣整齊的小菌落,將其命名為HPG-GZ-2017,其他組織未分離到。革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示,該分離菌為兩極濃染的革蘭陰性短小桿菌。

    2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察結(jié)果

    培養(yǎng)18 h后,在HPG-GZ-2017與金黃色葡萄球菌同時存在的巧克力瓊脂平板上,可見靠近葡萄球菌的分離菌菌落較大,而遠離葡萄球菌的菌落則相對較小(圖3)。

    2.4 分離菌生化試驗結(jié)果

    HPG-GZ-2017硝酸鹽還原試驗陰性;硫化氫、吲哚試驗、靛基質(zhì)試驗陰性;過氧化酶試驗陰性而氧化酶試驗陽性。該菌能發(fā)酵甘露糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不能發(fā)酵半乳糖。

    圖1 病雞眼瞼腫大、流膿

    圖2 肝臟有白色病灶

    圖3 分離株形成的衛(wèi)星現(xiàn)象

    2.5 分離菌藥敏試驗結(jié)果

    HPG-GZ-2017對頭孢克洛高敏,對紅霉素中敏,對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、青霉素、諾氟沙星、頭孢拉定低敏,對復方新諾明、鏈霉素耐藥(表2)。

    2.6 分離菌16 S rRNA PCR擴增結(jié)果

    經(jīng)凝膠電泳檢測,分離株HPG-GZ-2017的16 S rRNA PCR擴增結(jié)果與預期相符,片段長度約為1 450 bp(圖4)。

    2.7 分離菌16 S rRNA序列分析結(jié)果

    測序得到1 437 bp大小序列,將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的各亞型標準副雞嗜血桿菌菌株進行比對,核苷酸同源性為93.6%~99.4%。

    2.7.1 核苷酸同源性分析結(jié)果 核苷酸同源性分析表明,HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標準菌株CAPM 5113(GenBank:DQ229071)的同源性高達99.4%,與C型標準菌株HP107(GenBank:GU951544)、CAPM 5111(GenBank:M75056)、Modesto(GenBank:AY498870)的同源性都相對較高,分別為98.0%、98.2%、98.0%,與A、B型標準菌株的同源性在93.6%~97.3%之間(圖5)。

    表2 分離細菌藥敏試驗結(jié)果

    M.DNA 標準DL 2 000; -.陰性對照;1~2.分離物

    M.DNA Marker DL 2 000; -.Negative control;1-2.Isolates

    圖4分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

    Fig.4 PCR identification results of isolates

    2.7.2 系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果 系統(tǒng)進化樹分析顯示(圖6),HPG-GZ-2017與C型標準菌株CAPM 5111(GenBank:M75056)處于同一小分支,親緣關(guān)系最近,與A型標準菌株M10071(GenBank:AY613734)、M9919(GenBank:AY613739)以及B型標準菌株M6755(GenBank:AY613719.1)、M10816(GenBank:AY613725)親緣關(guān)系最遠。

    2.8 動物感染試驗結(jié)果

    將HPG-GZ-2017菌株接種各組10日齡小雞,4 d后各梯度試驗組和對照組雞均食欲正常,精神良好,沒有復制出IC典型特征癥狀。而各稀釋度菌株接種的巧克力瓊脂平板在24 h后均長出很密集的透明小菌落,根據(jù)計數(shù)原則全判定為多不可數(shù)。將試驗組雞處死并剖檢,其內(nèi)臟均未出現(xiàn)明顯病變,蘸取眶下竇分泌物接種于巧克力平板培養(yǎng)后長成與初分離菌形態(tài)一致的菌落,革蘭染色形態(tài)也與初分離時的形態(tài)一致。

    圖5 分離菌株HPG-GZ-2017株16 S rRNA序列同源性比對結(jié)果

    圖6 分離菌株HPG-GZ-2017 16 S rRNA序列系統(tǒng)進化樹

    3 討論

    本試驗的病料來源于貴州省某規(guī)模化養(yǎng)殖場,病雞有眼瞼腫大、流鼻液及呼吸困難等癥狀,與傳染性鼻炎典型癥狀相符。剖檢可見心包積液,這可能與A、C菌株分離的多糖有關(guān)[14]。另外,本試驗同時從病雞體內(nèi)檢測到了禽白血病病毒病原核酸,這很可能是引起病雞肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)的原因。

    該分離菌在未加NAD的血平板上不生長,在同樣未加NAD的巧克力平板上生長良好。這是因為巧克力平板制作過程中紅細胞會破裂,進而釋放出有利于該菌生長的Ⅴ因子(NADH)。在該菌與產(chǎn)NAD的葡萄球菌交叉劃線的巧克力平板上可見明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象,這些現(xiàn)象表明,該分離菌株具有NAD依賴性,這是鑒別該菌的重要依據(jù)[15-16]。細菌菌落為邊緣整齊的半透明小菌落,革蘭染色可見該菌為紅色的兩極濃染的短小桿菌,都符合副雞嗜血桿菌的特性。生化試驗結(jié)果表明,HPG-GZ-2017不能發(fā)酵半乳糖,且不含過氧化氫酶,說明該菌為副雞嗜血桿菌,而非其他禽桿菌[16]。由以上結(jié)果基本可判定該分離菌為副雞嗜血桿菌,將其命名為HPG-GZ-2017。序列分析結(jié)果表明,HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標準菌株CAPM 5113(GenBank:DQ229071)的同源性高達99.4%,由此可確定該菌株為嗜血桿菌。該菌與C型標準菌株的同源性比與A、B兩型標準菌株都高,且與C型菌株的親緣關(guān)系最近,因此確定該菌株為C型嗜血桿菌。

    將HPG-GZ-2017接種于未免疫傳染性鼻炎疫苗的10日齡小雞,4 d后可從小雞體內(nèi)分離到該細菌,但小雞不發(fā)生明顯病變,而貴州省某規(guī)模化養(yǎng)殖場的雞可見明顯的傳染性鼻炎典型癥狀,這可能受多種原因的影響。雖然各個年齡段的雞都可感染副雞嗜血桿菌,但成年雞的易感性遠大于雛雞[17],試驗雞日齡過小可能是未能復制出IC特征癥狀的其中一個原因。另外,雞場的飼養(yǎng)環(huán)境、感染劑量和感染方式等也可能是影響動物感染試驗結(jié)果的原因。為探明危害雞場雞的主要病原,我們對雞場送檢雞進行了一些常見的禽類病毒的病原核酸檢測,發(fā)現(xiàn)病雞體內(nèi)含有高濃度的J亞型禽白血病病毒。禽白血病是一種免疫抑制病,可降低雞的抵抗力,繼發(fā)其他病原的感染。雞場送檢雞患有禽白血病很可能是其出現(xiàn)典型IC癥狀的重要原因。藥敏試驗結(jié)果顯示,HPG-GZ-2017對頭孢克洛高度敏感,對大多數(shù)藥物低敏或耐藥,這與雞場濫用抗菌藥物有很大關(guān)系。防治傳染性鼻炎,不僅要注重飼養(yǎng)管理、嚴格執(zhí)行疫苗防疫,還應(yīng)注意預防禽白血病、馬立克病等免疫抑制性疾病的感染。

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