犀牛鉤蟲ITS1-5.8S-ITS2基因序列的對(duì)比分析

李 朝，李楊楊，宋偉斌，楊玉釗，楊建發(fā)，鄒豐才，劉永張*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；2.昆明動(dòng)物園，云南昆明 650021)

鉤蟲病(Hookworm diseases)是由寄生于人體及貓、狗等大多數(shù)哺乳動(dòng)物小腸內(nèi)的鉤蟲引起的寄生蟲病，鉤蟲是腸道寄生線蟲中危害最嚴(yán)重的蟲種。鉤口科(Ancylostomatidae)分為鉤口屬(Ancylostoma)、仰口屬(Bunostomum)、板口屬(Necator)、彎口屬(Uncinaria)和球首屬(Globocephalus)等。感染人體最常見(jiàn)的鉤蟲為美洲鉤蟲(Necatoramericanus)和十二指腸鉤蟲(Ancylostomaduodenale)[1-2]。寄生于貓和狗腸道中常見(jiàn)的鉤蟲為錫蘭鉤蟲(A.ceylanicum)、犬鉤蟲(A.caninum)和巴西鉤蟲(A.braziliense),也可感染人體，導(dǎo)致人獸共患寄生蟲病[3-4]。

長(zhǎng)期以來(lái)，動(dòng)物寄生蟲病原的蟲種鑒定主要是基于形態(tài)比較、寄生宿主、生活史等傳統(tǒng)分類學(xué)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)分類方法存在主觀性、周期性、局限性等諸多現(xiàn)實(shí)因素的限制，所以國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者開拓運(yùn)用分子生物學(xué)方法，尋找特異保守的標(biāo)記基因序列進(jìn)行系統(tǒng)分析。以PCR方法為基礎(chǔ)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(restriction fragment length polymorphism PCR,PCR-RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR (single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分類和鑒定[5-6]。寄生蟲的rDNA基因是一個(gè)值得選用的分子標(biāo)記，該基因含18 S、5.8 S和26 S rDNA，其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)分為ITS-1和ITS-2，前者位于18 S和5.8 S rDNA之間，后者位于5.8 S和26 S rDNA之間。本研究以從云南省某動(dòng)物園非洲白犀牛糞便中分離的鉤蟲為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增其ITS1-5.8S-ITS2 rDNA并進(jìn)行序列分析，旨在為今后野生動(dòng)物犀牛的鉤蟲分類、鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查以及對(duì)鉤蟲病的防控等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體樣品 本研究所用的鉤蟲分離自云南省昆明市動(dòng)物園內(nèi)飼養(yǎng)的觀賞非洲白犀牛糞便，飽和食鹽水漂浮法分離蟲卵后鏡檢、孵化和分離，分別命名為Usten1及Usten2; 保存于750 mL/L酒精中備用 。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；PCR試劑，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA提取 取孵化的2條犀牛鉤蟲，用滅菌超純水反復(fù)吹打沖洗2次～3次后，將蟲體置于新的1.5 mL離心管中，再用超純水反復(fù)沖洗，然后將超純水吸干凈。分別用SDS裂解緩沖液和蛋白酶K消化過(guò)夜，然后按DNA提取試劑盒使用說(shuō)明提取蟲體基因組總DNA。

1.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增犀牛鉤蟲ITS1-5.8S-ITS2序列的引物為擴(kuò)增線蟲ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 序列的保守引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′和NC2：5′-TTAGTTTCT TTTCCTCCGCT-3′[7]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。從單個(gè)犀牛鉤蟲樣品的基因組總DNA中經(jīng)PCR擴(kuò)增出ITS1-5.8S-ITS2片段，擴(kuò)增體系為25 μL，PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 5 min。同時(shí)設(shè)不加DNA模板的陰性對(duì)照和加DNA模板的陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照樣品為同屬線蟲的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲核酸)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.2.3 測(cè)序及對(duì)比分析 將經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，然后用SeqMan5.01軟件拼接。在線Blast比對(duì)分析，序列上傳NCBI- GenBank，與已公布的鉤蟲ITS1-5.8S-ITS2基因序列，用MEGA6.06軟件構(gòu)分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 蟲卵觀察結(jié)果

采用飽和食鹽水漂浮法分離獲得蟲卵后，在顯微鏡下檢查，蟲卵橢圓形，大小通常為79 μm～97 μm×47 μm～50 μm。兩端鈍圓，胚細(xì)胞大而數(shù)量少，內(nèi)含暗黑色顆粒(圖1)。

圖1 蟲卵觀察結(jié)果(100×)

2.2 ITS1-5.8S-ITS2序列的PCR擴(kuò)增

以提取的2條單個(gè)蟲體的基因組為模板，用NC5和NC2作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)不加DNA模板的陰性對(duì)照和加DNA模板的陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品為同屬線蟲的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲核酸。PCR產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可見(jiàn)約800 bp的條帶(圖2)， 與預(yù)期目的片段大小一致。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.Usten1；2.Usten2；-.陰性對(duì)照；+.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Usten1；2.Usten2；-.Negative control；+.Positive control

圖2犀牛鉤蟲ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的PCR產(chǎn)物

Fig.2 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA PCR-amplified from wormhook of rhino

2.3 ITS1-5.8S-ITS2序列分析

測(cè)序分析顯示， ITS1-5.8S-ITS2基因序列長(zhǎng)度均為781 bp，與Uncinariacf.(HE962182)和Uncinariasp.(HQ262066)的同源性分別為99%和98%。因此推測(cè)，非洲白犀牛感染的為彎口屬鉤蟲(Uncinaria)，序列上傳獲得注冊(cè)序列的登錄號(hào)是MF784938(781 bp)和MF784939(781 bp)。

目前，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中注冊(cè)報(bào)道的鉤蟲類ITS1-5.8S-ITS2基因系列有多段，其相關(guān)信息(分類、雌雄、宿主、分離地點(diǎn)、基因登錄號(hào))詳見(jiàn)表1。用表1中所列鉤蟲的ITS1-5.8S-ITS2基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和進(jìn)行同源性分析。其中，運(yùn)用最大簡(jiǎn)約分析(Maximum Parsimony analysis)(圖2)、鄰接分析(Neighbor-Joining analysis)(圖3)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000次自展值檢驗(yàn)，兩者在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上基本一致，表明此次分離的蟲卵彎口屬鉤蟲(Uncinaria)。

3 討論

此次樣品采集于云南省昆明動(dòng)物園的非洲白犀牛，雌雄各1頭，年齡約4歲，非洲引進(jìn)。2016年12月下旬抵達(dá)中國(guó)，隔離檢疫40余天后，2017年2月16日運(yùn)抵昆明動(dòng)物園。隔離檢疫期間，主飼苜蓿草、胡蘿卜等，未曾有發(fā)病記錄。抵達(dá)昆明動(dòng)物園后，主食沒(méi)有改變，適當(dāng)增加青草。2017年2月19日，犀牛從糞便里排出寄生蟲，線蟲、蠅蛆幼蟲各一。遂對(duì)犀牛消化道寄生蟲進(jìn)行仔細(xì)篩查，蟲卵數(shù)量為雌1100枚/g，雄900枚/g。同期采樣送往云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步的檢測(cè)分析。通過(guò)投喂鹽酸左旋咪唑7 g/kg，收到良好效果，此后的9個(gè)月內(nèi)，糞便內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到類似蟲卵。以此推斷,犀牛從非洲起運(yùn)前，體內(nèi)就有該線蟲寄生。長(zhǎng)途運(yùn)輸、環(huán)境改變、飲食規(guī)律打亂等因素，導(dǎo)致動(dòng)物體況、抵抗力下降，誘發(fā)體內(nèi)寄生蟲增殖，從糞便中排出蟲體。

表1 基于已報(bào)道鉤蟲ITS1-5.8S-ITS2基因系列的物種信息

圖3 最大簡(jiǎn)約分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 鄰接分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹

為了確定犀牛所感染的線蟲種類，采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定分類。ITS是核糖體DNA中介于18 S和28 S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS-1和ITS-2兩段序列，它具有進(jìn)化速度快、長(zhǎng)度短、在基因組不同單元間一致性好等特點(diǎn)，十分適合進(jìn)行各種分子操作；同時(shí)，它們?cè)谏镞M(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征，在種內(nèi)具有高度保守性，不同種間又有不同程度的差異。因此，ITS是廣泛應(yīng)用于寄生蟲種間分類鑒定的理想遺傳標(biāo)記[12-14]。ITS序列分析已被廣泛用于研究寄生蟲同一科內(nèi)屬間及屬下種間的遺傳關(guān)系。

非洲白犀(Ceratotheriumsimum)又叫白犀牛、方吻犀、寬吻犀等，屬奇蹄目，犀?？疲饕植加诜侵迻|部、南部和亞洲熱帶地區(qū)，其保護(hù)級(jí)別分別為世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄(https://www.iucn.org/)列為近危(CR)動(dòng)物、《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ國(guó)際二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。犀牛屬草食動(dòng)物，主要食物為雜草、果實(shí)、樹葉等，動(dòng)物自身不能分泌降解粗纖維的酶，其降解主要依賴于消化道中數(shù)量龐大的微生物，與反芻草食動(dòng)物相比，犀牛屬于單胃動(dòng)物，其盲腸和結(jié)腸容量較大，容易感染線蟲等消化道寄生蟲，影響腸道蠕動(dòng)節(jié)律和菌群微生物結(jié)構(gòu)分布，影響消化吸收，引發(fā)梗阻，繼而影響其生長(zhǎng)和繁殖[15-16]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)犀牛寄生蟲的報(bào)道極少，國(guó)外僅有少量的報(bào)道，主要包括血液寄生原蟲，如泰勒蟲、巴貝斯蟲、錐蟲等[17-21]，以及消化道寄生蠕蟲[22-23]。本研究從非洲白犀牛(Ceratotheriumsimum)糞便中分離鑒定的線蟲屬于鉤蟲科彎口屬鉤蟲(Uncinaria)，為野生珍稀動(dòng)物寄生蟲防控、豐富寄生蟲物種多樣性提供了參考，也為鉤蟲的進(jìn)一步分類、鑒定和遺傳變異研究奠定了基礎(chǔ)。